Détermination du rôle de la vitronectine dans la résistance bactérienne à l’activité bactéricide du sérum humain

Résumé

Source : Singh, B. et al., Assays for Study the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance.J. Vis. Exp.(2018)

Cette vidéo démontre le rôle de la vitronectine, une glycoprotéine sérique humaine, sur la résistance bactérienne. Les anticorps présents dans le sérum interagissent avec les protéines de surface bactériennes, activant les protéines du complément et formant le complexe d’attaque membranaire, provoquant la lyse des cellules bactériennes. La liaison de la vitronectine sur la protéine membranaire bactérienne empêche la formation du complexe d’attaque membranaire, ce qui entraîne la survie bactérienne.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Analyse de la résistance dépendante de Vn à l’activité bactéricide du sérum humain

1. Achetez du sérum humain normal (NHS) auprès d’une source commerciale. Préparez de la vitronectine ou du sérum appauvri en Vn (VDS). Réapprovisionnez le VDS avec 180 nM Vn, ce qui équivaut à Vn présent dans le NHS.
2. Préparez le sérum inactivé par la chaleur (HIS) en chauffant le NHS à 56 °C pendant 30 minutes afin d’inactiver les protéines du complément.
   note: La concentration sérique optimale (5 %) et le temps d’incubation (15 min) pour le test ont été déterminés empiriquement pour Haemophilus influenzae de type f (Hif) ; Ces paramètres peuvent varier pour d’autres agents pathogènes bactériens.
3. Cultiver des bactéries (dans ce cas, Hif M10 et le mutant Hif M10Δlph) jusqu’à la phase mi-log (DO₆₀₀ = 0,3). Bactéries en granulés par centrifugation à 3 500 x g pendant 10 min.
4. Remettre en suspension la pastille bactérienne avec 1 volume de tampon Veronal en gélatine de dextrose (DGVB⁺⁺ ; pH 7,3) contenant 2,5 % (p/v) de glucose, 2 mM de chlorure de magnésium, MgCl₂, 0,15 mM de chlorure de calcium, CaCl₂ et 0,1 % (poids/vol) de gélatine.
5. Ajouter 1,5 x 10³ unités formant colonies (UFC) de bactéries à 100 μL de DGVB⁺⁺ contenant 5 % de sérum (NHS, HIS, VDS ou VDS+180 nM Vn). Incuber l’échantillon à 37 °C pendant 15 min en agitant à 300 tr/min.
6. Prélever une aliquote de 10 μL du mélange réactionnel à 0 min (échantillon T₀) et 15 min (échantillon T_t) et déposer sur de l’agar-chocolat. Incuber la plaque à 37 °C pendant la nuit.
7. Après l’incubation, comptez les colonies apparaissant sur l’assiette. Calculez le pourcentage de bactéries tuées à l’aide de l’équation suivante : (unité formant colonie ou UFC à T_t)/(UFC à T₀) × 100.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polystyrène de 6 mL	VWR	Référence 89000-478	12 × 75 mm avec capuchon
Sérum humain normal (NHS)	Technologie du complément, Inc.	Nhs	Sérum humain en grappes
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	Réf. C5670-500G
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
gélatine	Sigma-Aldrich	Référence G9391	Convient pour la culture cellulaire
Hémocytomètre	Marienfeld	Référence 640210
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Vitronectine (Vn) à partir de plasma humain	Sigma-Aldrich	Réf. V8379-50UG	Qualité de culture cellulaire
secoueur	Stuart Scientific	STR6	Secoueur de plate-forme