Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Dissection et infection de la muqueuse utérine cervicale
REMARQUE : Pour des résultats optimaux, les explants de muqueuses cervicales doivent être traités et infectés le plus tôt possible après l’opération, idéalement le jour même de l’opération. Alternativement, les échantillons peuvent être stockés immergés dans des CMT (milieux de culture complétés par des antibiotiques) à 4°C pendant la nuit, et infectés immédiatement après la dissection.
- Laissez le CM suffisamment de temps pour atteindre le RT ou mettez-le dans un bain-marie préchauffé à 37°C. Complétez le CM avec une solution antibiotique (CMT) avant utilisation. Jetez toute solution antibiotique restante. Versez la solution d’éthanol à 70 % dans un récipient propre pour tremper la pince et le scalpel chaque fois que nécessaire pendant la procédure de dissection. Nettoyez les outils et changez la lame du scalpel entre les dissections d’échantillons provenant de plusieurs donneurs.
- À l’aide d’une pince stérile, transférez l’échantillon du récipient de transport dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 à 20 ml de CMT.
- Utilisez le couvercle de la boîte de Pétri comme surface de coupe pour disséquer le tissu. En tenant doucement le tissu à l’aide d’une pince, séparez la muqueuse de l’ectocol et/ou de l’endocol de l’utérus du tissu stromal et musculaire inférieur (sous-muqueuse) à l’aide d’un scalpel et d’une lame pour obtenir des bandes de muqueuse.
note: Lorsque vous travaillez sur un morceau de tissu, il est important de garder le reste du tissu immergé dans un milieu pour éviter la dessiccation des tissus.
- Coupez la muqueuse en bandes de 2 mm de large, puis retirez et jetez autant de sous-muqueuse que possible, en ne laissant qu’une couche de tissu de 2 mm d’épaisseur. Coupez les bandes en blocs de 2 mm d’épaisseur. Cela devrait aboutir à des explants de tissus d’environ 8 mm3.
Attention : La manipulation d’outils tranchants pour disséquer des échantillons humains augmente le risque de blessure et de contamination. L’opérateur doit envisager de porter des gants en métal, en maille et résistants aux coupures comme protection supplémentaire.
- Transférez les explants de tissus dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 à 20 ml de CMT pour éviter la dessiccation des tissus pendant la dissection. À la fin de la dissection, faites tourner la plaque pour randomiser la distribution de l’explant.
- À l’aide d’une pince stérile, transférez les explants dans le(s) tube(s) conique(s) stérile(s) de 1,5 mL (maximum 16 explants par tube). Retirez tout milieu dans le tube à l’aide d’une pipette.
- Décongeler la préparation de VIH-1 dans un bain-marie à 37 °C. Si nécessaire, diluez le stock de virus avec du CM. Transférez le virus dans le(s) tube(s) contenant les explants. Jetez toute préparation de virus résiduelle.
note: Le stock de virus doit être dilué de manière à ce que l’inoculum sélectionné soit contenu dans un volume d’au moins 0,5 mL (tableau 1). Pour réduire la variabilité des résultats entre les expériences indépendantes, la même préparation de virus doit être utilisée pour l’ensemble d’une étude (Table des matériaux).
- Transférez les tubes dans un agitateur thermique et incubez pendant 2 h à 37°C en les balançant à 300 tr/min. Retournez doucement les tubes plusieurs fois toutes les 30 à 60 min.
Remarque : Pour une infection efficace, il est essentiel d’utiliser le temps minimum requis entre la décongélation de la préparation du VIH-1 et le transfert des tubes à 37 °C.
- Remplissez une plaque de 6 puits avec 3 à 4 ml par puits de solution saline tampon de phosphate stérile (PBS). Au moment de l’incubation avec le VIH-1, jeter toute la préparation du virus dans le(s) tube(s) dans un récipient contenant une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Transférez les explants dans la plaque à 6 puits contenant le PBS à l’aide d’une pince.
- Laissez les explants reposer dans du PBS pendant 1 minute à RT, puis lavez-les en pipetant doucement le PBS de haut en bas dans le puits 2 à 3 fois. Jeter le PBS dans un récipient contenant une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Ajouter 3 à 4 ml de PBS neuf dans chaque puits. Répétez deux fois de plus pour un total de trois lavages. Jetez le PBS juste avant de transférer les explants sur les éponges pour éviter la dessiccation des tissus.
note: Les explants de la muqueuse cervicale, et en particulier de l’endocol de l’utérus, libèrent de grandes quantités de mucus lors de l’infection. Il est essentiel de laver et d’éliminer autant de mucus que possible, car une rétention non spécifique sur les explants et la libération ultérieure du virus dans le surnageant de culture peuvent masquer la réplication du virus.
- À l’aide d’une pince, transférez 5 à 8 explants sur chaque éponge de gélatine dans une plaque à 12 puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.
- Jetez tous les déchets biologiques dans des conteneurs opposés conformément aux règlements de l'institut sur la manipulation des produits biologiques dangereux et l'évaluation des risques spécifiques.
