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1. Mesure de l’IFN bioactif de type I à l’aide de cellules rapporteures HEK-Blue IFN-α/β.
Remarque : Ces cellules ont été générées par transfection stable de cellules HEK293 avec les gènes humains STAT2 et IRF9 pour obtenir une voie de signalisation IFN de type I pleinement active. Ils contiennent également le gène rapporteur de la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) sous le contrôle du promoteur ISG54 inductible par l’IFN-α/β. La stimulation de ces cellules avec de l’IFN de type I active la voie JAK/STAT/ISGF3 et induit la production de PAED.
- Maintenir les cellules HEK-Blue IFN-α/β dans le DMEM complété par 10 % de FBS. Plaquez-les à une densité de 50 000 cellules par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits, avec un volume final de 180 μl.
- Mélanger 220 μl de PBMC (dilués à 850 000 cellules/ml) ou 220 μl de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) (à une concentration allant de 100 000 à 500 000 cellules/ml) avec 30 μl de lymphocytes T infectés (dilués à 10,6 cellules/ml) par puits dans une plaque à 96 puits à fond en U.
- Incuber des co-cultures à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 18 à 22 heures, puis les transférer sur une plaque à 96 puits à fond en V. Centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g.
- Ajouter 20 μl de surnageant de co-culture dans chaque puits en double. Chaque plaque nécessite également un ensemble de contrôles d’étalons internes (IFNα humain, concentration finale de 100 U/ml à 2 500 U/ml). Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 18 à 22 heures.
- Déterminer les niveaux d’activité de la phosphatase alcaline à l’aide de la solution QUANTI-Blue, qui passe du rose au violet/bleu en présence de l’enzyme. Préparez QUANTI-Blue en suivant les recommandations du fabricant. Ajouter 180 μl de cette solution dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Dans chaque puits, ajoutez également 20 μl de cellules surnageantes de cellules IFN-α/β induites HEK-Blue et incubez la plaque dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce que la couleur se développe dans les puits de contrôle IFN standard.
- Évaluer les niveaux de PAED à l’aide d’un spectrophotomètre à 620-655 nm et déterminer la concentration d’IFN de type I par extrapolation à partir de la partie linéaire de la courbe standard de l’IFN.