Quantification d’interférons bioactifs de type I à l’aide d’un dosage rapporteur de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée

Résumé

Source : Bego, M. G. et al., Évaluation de la détection innée des lymphocytes T CD4⁺ infectés par le VIH-1 par des cellules dendritiques plasmacytoïdes à l’aide d’un système de co-culture ex vivo. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre un dosage de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée à l’aide de cellules porteuses d’interféron-α/β HEK-Blue pour quantifier les interférons de type I (IFN) libérés à la suite de la stimulation de cellules dendritiques plasmacytoïdes par des cellules T CD4⁺ infectées par le VIH-1.

Protocole

1. Mesure de l’IFN bioactif de type I à l’aide de cellules rapporteures HEK-Blue IFN-α/β.

Remarque : Ces cellules ont été générées par transfection stable de cellules HEK293 avec les gènes humains STAT2 et IRF9 pour obtenir une voie de signalisation IFN de type I pleinement active. Ils contiennent également le gène rapporteur de la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) sous le contrôle du promoteur ISG54 inductible par l’IFN-α/β. La stimulation de ces cellules avec de l’IFN de type I active la voie JAK/STAT/ISGF3 et induit la production de PAED.

1. Maintenir les cellules HEK-Blue IFN-α/β dans le DMEM complété par 10 % de FBS. Plaquez-les à une densité de 50 000 cellules par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits, avec un volume final de 180 μl.
2. Mélanger 220 μl de PBMC (dilués à 850 000 cellules/ml) ou 220 μl de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) (à une concentration allant de 100 000 à 500 000 cellules/ml) avec 30 μl de lymphocytes T infectés (dilués à 10,6 cellules/ml) par puits dans une plaque à 96 puits à fond en U.
3. Incuber des co-cultures à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 18 à 22 heures, puis les transférer sur une plaque à 96 puits à fond en V. Centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g.
4. Ajouter 20 μl de surnageant de co-culture dans chaque puits en double. Chaque plaque nécessite également un ensemble de contrôles d’étalons internes (IFNα humain, concentration finale de 100 U/ml à 2 500 U/ml). Incuber les plaques à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 18 à 22 heures.
5. Déterminer les niveaux d’activité de la phosphatase alcaline à l’aide de la solution QUANTI-Blue, qui passe du rose au violet/bleu en présence de l’enzyme. Préparez QUANTI-Blue en suivant les recommandations du fabricant. Ajouter 180 μl de cette solution dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Dans chaque puits, ajoutez également 20 μl de cellules surnageantes de cellules IFN-α/β induites HEK-Blue et incubez la plaque dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce que la couleur se développe dans les puits de contrôle IFN standard.
6. Évaluer les niveaux de PAED à l’aide d’un spectrophotomètre à 620-655 nm et déterminer la concentration d’IFN de type I par extrapolation à partir de la partie linéaire de la courbe standard de l’IFN.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules MT4	Programme de réactifs du NIH pour le sida	120	Ce réactif a été obtenu par le biais du programme de réactifs du NIH sur le sida, Division du sida, NIAID, NIH : MT-4 du Dr Douglas Richman.
HEK-Blu Cellules rapporteures IFN-α/β	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	bison d’europe	350-000-CL
DMEM	bison d’europe	Référence 319-005-CL
FBS	bison d’europe	N° 080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	O2769
Kit d’isolement des lymphocytes T CD4+ II	Myltenyi	Tél. : 130-091-155
Kit d’isolement de cellules dendritiques plasmacytoïdes Diamond II	Myltenyi	Tél. : 130-097-240
QUANTI-Bleu	Cedarlane	REP-QB2
2,5 mg/ml d’IgG humaines	Sigma-Aldrich	J 4506