Technique de génération de particules semblables à un virus de la grippe par l’intermédiaire d’un système de mammifère

Résumé

Source : Arevalo, M. T., et al.Expression et purification de particules pseudo-virales pour la vaccination. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre la génération de particules pseudo-virales de la grippe (VLP) dans un système de mammifères. Lors de l’expression de trois vecteurs d’expression eucaryotes – codant pour différentes protéines structurelles virales – dans des cellules hôtes de mammifères appropriées, les protéines virales exprimées s’auto-assemblent en VLP sur la membrane plasmique de l’hôte et se libèrent par bourgeonnement à partir de la surface cellulaire.

Protocole

1. Système d’expression de mammifères pour la génération de la grippe H3N2 VLP

1. Sous-clonez les glycoprotéines structurelles virales hémagglutinine (HA), neuraminidase (NA) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) Gag (antigène spécifique du groupe) p55 dans des vecteurs d’expression eucaryotes, tels que pTR600 précédemment décrit.
2. Amplifiez l'ADN d'Escherichia coli chimiquement compétent (p. ex., DH5α) et isolez le plasmide de qualité transfection à l'aide d'une trousse de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. La quantité d'ADN dépend du rendement et des besoins de l'utilisateur.
3. Maintenir la lignée cellulaire de mammifère, 293T, dans un milieu de croissance contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
4. Cultiver les cellules de telle sorte qu’un ballon de culture tissulaire T-150 contienne 45 à 75 x 10⁶ cellules par ballon, de sorte que le ballon obtienne une adhérence cellulaire complète et une confluence cellulaire de 85 à 95 % le jour suivant. Inspectez les cellules au microscope pour trouver la confluence souhaitée.
   note: Une densité cellulaire élevée est généralement recommandée pour obtenir une expression optimale des protéines avec une cytotoxicité minimale lors de l’utilisation de réactifs de transfection commerciaux, cependant, une confluence excessive peut entraîner une accumulation de sous-produits de déchets cellulaires et réduire la viabilité cellulaire.
5. Le jour de la transfection, préparer un mélange de liposomes et d'ADN selon les recommandations du fabricant et transfecter des cellules d'ADN avec une composition d'ADN de 1:1:2 de HA :NA :Gag avec une quantité totale d'ADN de 40 μg par fiole T-150. Diluer les solutions d’ADN et de liposomes dans un milieu de transfection sans sérum sans antibiotiques de sorte que chaque fiole contienne un volume total de 20 à 30 ml
   note: Le rapport entre les constructions génétiques peut nécessiter une optimisation par l’utilisateur. Bien que cela n’ait pas été démontré ici, une procédure de transfection similaire a été réalisée avec le virus respiratoire syncytial (VRS) F et le HIV Gag dans un rapport de 1:1. Pour les plasmides à expression unique DENV et CHIKV, un total de 20 μg d’ADN par fiole T-150 est utilisé pour une expression optimale. Les ratios de réactifs ADN :transfection sont optimisés par l’utilisateur. Utilisez le milieu de transfection recommandé basé sur la méthode de transfection, c’est-à-dire que les transfections lipidiques polycationiques recommandent la réduction ou l’absence de sérum fœtal bovin, de sorte que le milieu peut être complété par des hormones de croissance et des oligo-éléments pour favoriser la croissance en l’absence de sérum.
6. Remettre les flacons à 37 °C avec un incubateur à 5 % de CO₂. Pour un volume de 200 ml, utiliser 9 flacons T-150. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture par transfection jusqu’au jour de la récolte de la VLP.
7. Récolter le surnageant de culture à partir de cellules après 72 à 96 heures après la transfection, selon l’antigène, ou lorsque la viabilité cellulaire a diminué à 70-80 %, comme estimé par inspection microscopique. Transvaser le surnageant dans des tubes coniques de 50 ml et faire tourner les cellules à 500 × g pendant 5 min à 4 °C pour les réduire en granulés de débris cellulaires.
   Remarque : Le remplacement du surnageant de 3 jours par un milieu de transfection frais préchauffé et sans sérum vers des cellules adhérentes produira un deuxième lot de VLP avec un rendement similaire ou légèrement réduit et doit être optimisé par l’utilisateur.
8. Surnageant de la piscine et filtration à travers une membrane interstitielle de 0,22 μm avant la sédimentation par ultracentrifugation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit Maxi Plasmid	Qiagen	Référence 12163
DMEM	Cellgro	Référence 10-013
Lipofectamine	Technologies de la vie	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Technologies de la vie	31985062
Plaque d’agitation multipoint Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596
Tubes à ultracentrifuger Polyclear	Seton	Référence 7025
Dessus du filtre à vide de 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Référence 569-0020
glycérol	sigma	Référence G5516