Génération de particules semblables au virus Chikungunya à l’aide d’un système d’expression de baculovirus dans des cellules d’insectes

Résumé

Source : Arevalo, M. T. et al., Expression et purification de particules pseudo-virales pour la vaccination.J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre comment des particules pseudo-virales, les VLP sont générées en infectant des cellules d’insectes avec un baculovirus recombinant portant la cassette de gènes du virus chikungunya. Le virus recombinant infecte les cellules, entraînant la formation, l’assemblage et la libération de VLP dans le milieu de culture pour une utilisation potentielle dans la production de vaccins.

Protocole

1. Expression de particules semblables au virus Chikungunya (VLP) à l’aide d’un système cellulaire de baculovirus/insecte

1. Générer un baculovirus recombinant exprimant les protéines de capside et d’enveloppe du virus du chikungunya (C-E3-E2-6K-E1) à partir de la souche S-27 à l’aide d’un système d’expression de baculovirus commercial.
2. Cultivez des cellules de Spodoptera frugiperda Sf9 dans un milieu de croissance Sf9 sans sérum avec 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine à 28 °C. Utilisez 3-5 x 10⁵ c/ml pour initier les cultures en flacon rotatif pour la croissance des cellules en suspension. Passage régulier lorsqu’ils atteignent des densités cellulaires de 2-4 x 10⁶ c/ml (tous les 3-4 jours).
3. Culture de cellules Sf9 en suspension dans des fioles tournantes avec agitation à 130 tr/min sur un système de plaque d’agitation multipoint. Pour une bonne aération, maintenir les volumes de culture à ne pas dépasser la moitié du volume de la fiole essoreuse.
4. Pour l’expression des VLP de Chikungunya ou CHIK, infecter les cellules Sf9 à une densité de 2 x 10⁶ cellules/ml avec un baculovirus recombinant à une multiplicité d’infection de 1 et retourner dans l’incubateur à 28 °C. En règle générale, infectez une ou deux fioles tournantes, contenant 250 ml de cellules Sf9.
   note: Bien que nous n’utilisions pas cette méthode, les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans des flacons agitateurs à 28 °C à l’aide d’une plate-forme agitée.
5. Récoltez les cultures 72 à 96 heures après l'infection, ou lorsque la viabilité cellulaire a diminué à 70-80 %, comme déterminé par l'exclusion du bleu trypan selon le protocole du fabricant><. note: Les cellules continuent de proliférer pendant l’infection et il y a une viabilité de ~80 % dans les cultures Sf9 infectées par le baculovirus recombinant CHIK VLP à 3 jours après l’infection (dpi). Les cellules infectées par le baculovirus sont plus grandes en apparence. La morphologie peut également passer de ronde à oblongue. Dans les derniers stades des infections à baculovirus, les cellules ont commencé à lyser.
6. Transférez les cultures directement de la culture en suspension dans des tubes coniques de 50 ml et faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
7. Recueillir les surnageants et filtrer à travers une membrane interstitielle de 0,22 μm avant la sédimentation par ultracentrifugation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Opti-MEM I	Technologies de la vie	31985062
Système d’expression de baculovirus de bac à bac	Technologies de la vie	Référence 10359-016
Dessus du filtre à vide de 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Référence 569-0020
SFM SFM (en anglais seulement)	ThermoFisher Scientific	Référence 10902-096
Plaque d’agitation multipoint Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596