Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Manipulation des animaux, préparation et induction de l’inflammation
- Utilisez des souris mâles âgées de 4 à 6 semaines avec un poids compris entre 16 et 20 g. Remarque : Si les souris sont plus âgées ou plus lourdes, elles présentent un excès de graisse autour du vaisseau, limitant l’observation microscopique.
- Stérilisez tous les outils et la table du microscope avant l’opération.
- Injecter 20 mg/kg de LPS (lipopolysaccharide) par voie intrapéritonéale 4 heures avant la microscopie chez la souris vivante pour induire une inflammation bactérienne.
- Préchauffez une solution saline à 0,9 % dans un bain-marie à 37 °C pour humidifier la chambre en plastique et le tissu du mésentère.
- Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) juste avant la procédure de microscopie. Une anesthésie alternative peut être utilisée, par exemple, l’inhalation d’isoflurane à 2 %. Confirmer la bonne anesthésie par la perte de réponse à la stimulation réflexe (pincement de l’orteil ou de la queue avec pression ferme).
- Épilez l’abdomen à l’aide d’un rasoir et enlevez les poils morts avec de la gaze saturée d’éthanol à 70 %.
- Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse, sous anesthésie.
2. Chirurgie
- Stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Cette méthode n’est pas stérile et pourrait être mortelle à la fin de l’expérience.
- Effectuer une laparotomie médiane : Ouvrez la peau abdominale à l’aide de petites pinces incurvées et de petits ciseaux. Identifiez les vaisseaux épigastriques et ouvrez le péritoine dans la région de la linea alba, pour protéger les vaisseaux.
- Appliquez quelques gouttes de solution saline préchauffée dans la cavité abdominale pour garder les tissus humides.
- Marquer les leucocytes et les plaquettes par fluorescence en injectant 50 μl de rhodamine 6G (1 mg/ml) par voie rétro-orbitaire.
- Extériorisez une boucle d’iléon et placez-la dans une boîte de Pétri d’un diamètre de 10 cm ; assurez-vous de garder le tissu humide en appliquant la solution saline préchauffée à 37 °C (0,9 %) toutes les deux minutes.
3. Microscopie intravitale
- Placez la souris sous le microscope et placez la veine du mésentère d’un diamètre de 200 à 300 μm au centre de la vue. Choisissez un récipient sans environnement gras visible.
- Ne touchez pas les vaisseaux du mésentère, évitant ainsi la stimulation de l’endothélium. Manipulez l’anse de l’iléon avec précaution.
- Visualisez les interactions entre les cellules sanguines et l’endothélium à l’aide d’un microscope inversé ou droit et d’une caméra à l’aide d’un logiciel de microscope. Enregistrez les interactions entre les cellules sanguines et l’endothélium pendant 1 minute dans 4 veines différentes par souris.
- Euthanasier la souris par luxation cervicale après la fin des expériences d’imagerie.
4. Analyse
- Effectuez l’analyse hors ligne et à l’aveugle pour tous les paramètres. Effectuez l’analyse à l’aide de tout logiciel approprié.
- Confirmez des conditions de flux sanguin stables et interindividuelles comparables dans des ciné-clips à haute résolution temporelle (fréquence d’images maximale) axés sur le flux de cellules sanguines intraluminales.
- Quantifiez le nombre de leucocytes roulants. Par conséquent, tracez une ligne verticale à travers la veine et comptez tous les leucocytes traversant cette ligne en 1 min.
- Déterminez la vitesse de roulement en mesurant le temps dont un seul leucocyte a besoin pour parcourir une distance de 50 μm tout en roulant de manière stable sur l’endothélium. Pour ce faire, tracez deux lignes verticales à une distance de 50 μm à travers la veine.
- Mesurez le temps dont un leucocyte représentatif a besoin pour se déplacer d’une ligne à l’autre. Calculez la vitesse des leucocytes en divisant 50 μm par le temps nécessaire (μm/s).
- Mesurer l’adhérence des leucocytes dans un champ de 0,04 mm2. Pour ce faire, tracez un carré d’une longueur de côté de 200 μm dans la veine.
- Comptez les leucocytes adhérents fermes, définis comme l’absence de mouvement visible pendant 30 secondes, à l’intérieur de ce carré.
- Comptez le nombre de plaquettes liées à un leucocyte pour quantifier les interactions plaquettes-leucocytes.
