Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation d’antigène pour injection sous-cutanée
- Effectuer toutes les procédures de cette section à l’intérieur d’une hotte chimique pour éviter l’inhalation ou le contact cutané avec la poudre de Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Traitez conformément aux politiques de votre établissement l'adjuvant de Freund complet (généralement BSL-1). Cela comprend l’utilisation de gants résistant aux produits chimiques, de lunettes de sécurité et de vêtements de travail de protection (blouse de laboratoire).
- Utiliser une bonne technique stérile pour éviter la contamination des réactifs qui seront introduits dans les animaux de laboratoire.
- Préparez la suspension de Mtb dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en mélangeant 5 mg de poudre de Mycobacterium tuberculosis H37Ra lyophilisée et tuée par la chaleur avec 2,5 mL de PBS froid dans un tube de microcentrifugation de 5 mL. Vortex une fois pendant 30 secondes, puis placez sur de la glace.
- Pour générer une suspension fine du H37Ra en PBS, sonicer la suspension sur de la glace pendant 5 min.
- Détachez le corps de l’unité de conversion et nettoyez la sonde avec un tampon d’alcool à 70 % (v/v).
- Allumez le sonicateur, réglez le réglage de puissance sur 4 en tournant le bouton de commande de puissance et plongez l'extrémité de la sonde dans la poudre mycobactérienne contenant du PBS. Assurez-vous que la pointe de la sonde est immergée à au moins la moitié de la profondeur de l’échantillon et que la pointe de la sonde ne touche pas la paroi du tube de la microcentrifugeuse.
- Soniquez le mélange sur de la glace pendant 30 secondes, faites une pause de 30 secondes et répétez l’opération pendant un total de 5 minutes pour disperser complètement la poudre en une suspension uniforme sans chauffer le liquide.
- Ajoutez 2,5 ml d'adjuvant incomplet de Freund au mélange et répétez le processus de sonication sur de la glace jusqu'à ce que l'émulsion forme une consistance semblable à celle d'un dentifrice.
- Réglez la puissance sur 0 à l’aide du bouton de commande et éteignez l’appareil pour terminer la sonication. Retirez l’embout de la suspension et essuyez la sonde avec un tampon imbibé d’alcool.
- Conservez l’émulsion d’antigène à 4 °C. La fabrication de lots de l’émulsion aidera à assurer l’uniformité entre les expériences. L’émulsion peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 mois.
2. Injection sous-cutanée
- Effectuer l’injection sous-cutanée une semaine avant l’injection intravitréenne (désignée comme le jour -7).
- Chargez une seringue de 1 mL (sans aiguille attachée) avec l’émulsion mycobactérienne. En raison de la viscosité et de l’opacité de l’émulsion, des bulles d’air difficiles à voir peuvent remplir la seringue.
- Pour éviter la formation de bulles d’air dans la seringue, après avoir rempli 0,2 à 0,3 mL d’émulsion, retournez la seringue (embout vers le haut) et tapotez doucement la seringue à plusieurs reprises sur le bord d’un comptoir pour faire remonter les bulles à la surface.
- Expulsez l’air de la seringue et continuez à remplir la seringue. Retournez et tapotez par intermittence jusqu’à ce que le mélange soit rempli.
- Placez une aiguille de 25 G sur la seringue et faites avancer l’émulsion pour remplir l’aiguille. Conservez la seringue sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.
- Pour effectuer l'injection sous-cutanée en toute sécurité, anesthésie la souris ou utilise des méthodes de contention humaines qui permettent un accès facile à l'arrière-train de l'animal.
- Pour anesthésier en vue d’une injection sous-cutanée, placez l’animal dans une chambre d’induction à l’isoflurane (3 % à 4 % pour l’induction et 1 % à 3 % pour l’entretien). Une fois anesthésiée, assurez-vous que la souris a un rythme respiratoire lent et ne présente aucun signe de détresse respiratoire.
- Placez les injections sous-cutanées sur la surface dorsale des hanches ou sur la surface ventrale des jambes proximales de la région des ganglions lymphatiques inguinaux.
- Insérez soigneusement l’aiguille pour éviter l’injection dans le muscle. Injecter 0,05 mL de l’émulsion Mtb dans l’espace sous-cutané. Ne retirez pas l’aiguille immédiatement afin de permettre à l’émulsion épaisse d’être complètement injectée.
- Répéter l’injection sur les côtés gauche et droit pour un total de 0,1 mL par animal.
- En cas d’anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant chaud jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Remettez la souris dans sa cage une fois complètement rétablie et étiquetez la carte de la cage avec la date de l’injection sous-cutanée.
- Fournir une analgésie avec de l’acétaminophène oral (200 mg/kg/jour), mais pas d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) car les agents anti-inflammatoires peuvent avoir un impact sur l’induction de l’uvéite.