Un modèle murin d’uvéite mycobactérienne amorcée pour étudier l’uvéite post-infectieuse

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation d’antigène pour injection sous-cutanée

1. Effectuer toutes les procédures décrites dans cette section à l’intérieur d’une hotte chimique pour éviter l’inhalation ou le contact cutané avec la poudre de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Traitez conformément aux politiques de votre établissement l'adjuvant de Freund complet (généralement BSL-1). Cela comprend l’utilisation de gants résistant aux produits chimiques, de lunettes de sécurité et de vêtements de travail de protection (blouse de laboratoire).
2. Utiliser une bonne technique stérile pour éviter la contamination des réactifs qui seront introduits dans les animaux de laboratoire.
3. Préparez la suspension de Mtb dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en mélangeant 5 mg de poudre de Mtb H37Ra lyophilisée et tuée thermiquement avec 2,5 ml de PBS froid dans un tube de microcentrifugation de 5 ml. Vortex une fois pendant 30 secondes, puis placez sur de la glace.
4. Pour générer une suspension fine du H37Ra en PBS, sonicer la suspension sur de la glace pendant 5 min.
   1. Détachez le corps de l’unité de conversion et nettoyez la sonde avec un tampon d’alcool à 70 % (v/v).
   2. Allumez le sonicateur, réglez le réglage de puissance sur 4 en tournant le bouton de commande de puissance et plongez l'extrémité de la sonde dans la poudre mycobactérienne contenant du PBS. Assurez-vous que la pointe de la sonde est immergée à au moins la moitié de la profondeur de l’échantillon et que la pointe de la sonde ne touche pas la paroi du tube de la microcentrifugeuse.
5. Soniquez le mélange sur de la glace pendant 30 secondes, faites une pause de 30 secondes et répétez l’opération pendant un total de 5 minutes pour disperser complètement la poudre en une suspension uniforme sans chauffer le liquide.
6. Ajoutez 2,5 ml d'adjuvant incomplet de Freund au mélange et répétez le processus de sonication sur de la glace jusqu'à ce que l'émulsion forme une consistance semblable à celle d'un dentifrice.
7. Réglez la puissance sur 0 à l’aide du bouton de commande et éteignez l’appareil pour terminer la sonication. Retirez l’embout de la suspension et essuyez la sonde avec un tampon imbibé d’alcool.
8. Conservez l’émulsion d’antigène à 4 °C. La fabrication de lots de l’émulsion aidera à assurer l’uniformité entre les expériences. L’émulsion peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 mois.

2. Injection sous-cutanée

1. Effectuer l’injection sous-cutanée une semaine avant l’injection intravitréenne (IVT) (désignée comme le jour -7).
2. Chargez une seringue de 1 mL (sans aiguille attachée) avec l’émulsion mycobactérienne. En raison de la viscosité et de l’opacité de l’émulsion, des bulles d’air difficiles à voir peuvent remplir la seringue.
   1. Pour éviter la formation de bulles d’air dans la seringue, après avoir rempli 0,2 à 0,3 mL d’émulsion, retournez la seringue (embout vers le haut) et tapotez doucement la seringue à plusieurs reprises sur le bord d’un comptoir pour faire remonter les bulles à la surface.
3. Expulsez l’air de la seringue et continuez à remplir la seringue. Retournez et tapotez par intermittence jusqu’à ce que le mélange soit rempli.
4. Placez une aiguille de 25 G sur la seringue et faites avancer l’émulsion pour remplir l’aiguille. Conservez la seringue sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.
5. Pour effectuer l'injection sous-cutanée en toute sécurité, anesthésie la souris ou utilise des méthodes de contention humaines qui permettent un accès facile à l'arrière-train de l'animal.
6. Pour anesthésier en vue d’une injection sous-cutanée, placez l’animal dans une chambre d’induction à l’isoflurane (3 % à 4 % pour l’induction et 1 % à 3 % pour l’entretien). Une fois anesthésiée, assurez-vous que la souris a un rythme respiratoire lent et ne présente aucun signe de détresse respiratoire.
7. Placez les injections sous-cutanées sur la surface dorsale des hanches ou sur la surface ventrale des jambes proximales de la région des ganglions lymphatiques inguinaux.
   1. Insérez soigneusement l’aiguille pour éviter l’injection dans le muscle. Injecter 0,05 mL de l’émulsion Mtb dans l’espace sous-cutané. Ne retirez pas l’aiguille immédiatement afin de permettre à l’émulsion épaisse d’être complètement injectée.
   2. Répéter l’injection sur les côtés gauche et droit pour un total de 0,1 mL par animal.
8. En cas d’anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant chaud jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
9. Remettez la souris dans sa cage une fois complètement rétablie et étiquetez la carte de la cage avec la date de l’injection sous-cutanée.
10. Fournir une analgésie avec de l’acétaminophène oral (200 mg/kg/jour), mais pas d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), car les agents anti-inflammatoires peuvent avoir un impact sur l’induction de l’uvéite.

3. Préparation de stock d’antigènes pour injection intravitréenne

1. Effectuez toutes les procédures de cette section dans des conditions stériles appropriées pour éviter la contamination de la suspension intravitréenne de Mtb.
2. Fabriquez les suspensions intravitréennes.
   1. Pour l’induction d’une panuvéite légère à modérée, préparez la suspension intravitréenne à une concentration de 5 mg/mL en ajoutant 5 mg d’extrait de mycobactéries à 1 mL de 1x PBS.
   2. En cas d’induction d’une panuvéite modérée à sévère, faire la suspension intravitréenne à une concentration de 10 mg/mL en ajoutant 10 mg d’extrait de mycobactéries à 1 mL de 1x PBS.
3. Vortex une fois pendant 30 secondes, puis placez sur de la glace.
4. Pour générer une suspension fine du H37Ra dans le PBS, soniser la suspension sur de la glace pendant 10 minutes comme décrit à l’étape 1.4. Aliquote cette solution mère dans des volumes de 100 μL et conservez-la à -20 °C.
5. Avant utilisation, décongeler à température ambiante et agiter à puissance élevée pendant 1 min. Conservez les aliquotes sur de la glace pendant leur transport vers l’animalerie.

4. Procédure d’injection intravitréenne le jour 0

1. Préparation des animaux
   1. Portez des gants d’examen ajustés et placez la souris sur une balance pour obtenir son poids en grammes.
   2. Administrer une injection intrapéritonéale de 0,02 mL/g de poids corporel d’une solution contenant 100 mg/mL de kétamine et 20 mg/mL de xylazine mélangées à de l’eau stérile pour anesthésier l’animal. Une autre approche consiste à utiliser l’induction à l’aide de ~1,5 % d’isoflurane (inhalé).
   3. Attendez environ 2 minutes que la souris s’endorme, puis placez-la dans une boîte chauffante et couvrez le couvercle. Effectuez des tests de réflexe de douleur comme le pincement de l’oreille, de l’orteil et de la queue pour évaluer la profondeur de l’anesthésie pour la procédure.
   4. Une fois endormi, anesthésez la cornée avec 1 goutte de tétracaïne à 0,5 % (v/v). Évitez de mettre de la tétracaïne près du nez ou de la bouche de la souris. Après 10 s, tamponnez l’excès de liquide.
      note: Il a été observé que la dilatation de l’iris et la visualisation de la chambre antérieure (CA) sont améliorées lors de l’administration d’une anesthésie topique, peut-être en raison d’une amélioration de la suppression du réflexe cornéen avec l’anesthésie systémique et topique combinée. Cependant, cette étape peut être omise si vous le souhaitez.
   5. Dilater la pupille avec 1 goutte de phényléphrine à 2,5 % (v/v). Soyez prudent pour éviter tout excès de gouttelettes qui pourraient pénétrer dans le nez ou la bouche. Après 2-3 min, tamponnez l’excès de liquide.
   6. Pour diminuer le risque d’endophtalmie, ajoutez 1 goutte de bétadine à 5 % à la surface de l’œil et aux cheveux environnants. Laisser agir sur l’œil pendant 2-3 min.
      note: Effectuer toutes les procédures décrites dans cette section dans des conditions stériles appropriées pour prévenir l’endophtalmie.
   7. Retirez la bétadine et couvrez l’œil avec de l’hypromellose (0,3 %) ou du gel pour les yeux carbomère 0,2 % p/p) pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Cela aidera également à prévenir la formation de cataracte.
2. Mise en place du système de micro-injection
   1. Effectuez l’injection intravitréenne à l’aide d’une micropompe reliée à un contrôleur de pompe à microseringue et à une seringue d’injection (Figure 1A-C). Vous pouvez également injecter avec une aiguille de 33 G attachée à une seringue Hamilton comme décrit à la sous-section 4.4.
   2. Connectez une aiguille de 34 G au support d’injection pour assembler l’injecteur. Desserrez le capuchon à vis argenté à l’extrémité avant du porte-injection et faites glisser l’aiguille dans le corps du support à mi-chemin. Serrez le bouchon à vis argenté pour serrer les doigts.
   3. Connectez la tubulure au support d’injection comme mentionné aux étapes 4.2.4-4.2.5.
   4. Pour insérer le tube sur le support d’injection, desserrez la vis en plastique à l’arrière du support, faites glisser le tube à travers le joint à l’intérieur et serrez la vis.
   5. Maintenez un léger espace avec l’extrémité de la tubulure pour éviter d’endommager la tubulure pendant l’injection. Reportez-vous à la figure 1C.
   6. Décongeler une aliquote de 100 μL de la suspension mère de mycobactérie.
   7. Ajouter 3 μL d’une solution de fluorescéine sodique à 1 % (AK-Fluor) et bien agiter.
   8. Chargez une seringue de 10 μL avec le mélange d’antigène et de fluorescéine sans inclure de bulles d’air.
   9. Retirez l’aiguille de chargement de la seringue et faites glisser le tube à travers le joint de bouchon à vis argenté jusqu’à ce que l’embout atteigne le repère zéro dans le corps de la seringue.
   10. Une fois que l’extrémité du tube est correctement alignée dans la position souhaitée, serrez le bouchon à vis à la main.
   11. Rincez la solution dans la seringue à travers la tubulure d’injection pour charger complètement le système. Répétez ensuite les étapes 4.2.8 à 4.2.11 pour recharger la seringue pour l’injection.
   12. Pour installer la seringue chargée sur la micropompe, appuyez sur le bouton de déverrouillage de la pince à l’extrémité de la micro-pompe pour ouvrir les pinces de seringue.
   13. Positionnez le capuchon du piston dans le support de capuchon du piston à l’extrémité arrière de la micropompe.
   14. Faites ensuite glisser le collier de la seringue sur la butée du collier et le corps de la seringue dans la pince de seringue.
   15. Relâchez le bouton de serrage et serrez la vis de retenue du piston. Reportez-vous à la figure 1D.
   16. Faites glisser le support d’injection et l’aiguille à travers la pince en O de l’appareil d’injection stéréotaxique. Il s’agit d’une plateforme personnalisée ; Alternativement, la seringue peut être tenue et positionnée manuellement.
   17. Réglez le volume de perfusion et le débit de volume de perfusion sur le contrôleur de la micro-pousse-seringue pour injecter 500 nL par cycle à un débit de 40 nL/s, respectivement.
       note: Des taux d’injection plus rapides peuvent être utilisés, mais plus de reflux peut être ressenti avant que le repositionnement de l’aiguille puisse être réalisé.
   18. Testez le système pour vous assurer qu’il fonctionne correctement avant d’effectuer une injection intravitréenne.
       note: Lorsque le système d’injection fonctionne correctement, l’activation d’un cycle d’injection à l’aide de la pédale ou de la manette produira un mouvement visible du support du piston et une petite gouttelette de liquide verdâtre sera visible à la pointe de l’aiguille. Dans le cas où aucun liquide n’est produit, activez des cycles supplémentaires ou rincez et rechargez la seringue.
   19. Avant d’injecter l’œil, essuyez doucement l’aiguille avec un tampon d’éthanol à 95 %.
3. Procédure d’injection intravitréenne
   1. La souris est placée sur un appareil stéréotaxique pour effectuer la procédure d’injection.
   2. Gardez la scène/plate-forme sur laquelle la souris repose au chaud en fixant 2-3 serviettes en papier sur sa surface.
   3. Placez la souris en position couchée sur la plate-forme. Utilisez les barres d'oreille droite et gauche pour fixer doucement la tête de l'animal. Reportez-vous à la figure 1E.
   4. Positionnez la souris et orientez-la sous la lunette de manière à ce que la face nasale supérieure de l’œil droit soit visible.
   5. Utilisez une aiguille de 30 G pour déplacer les cils et exposer la sclère. Visualisez le limbe et le vaisseau sanguin radial.
   6. À l’aide d’une aiguille stérile de 30 G, faites un trou de guidage dans la sclérotique de 1 à 2 mm en arrière du limbe.
   7. Insérez l’aiguille 34 G fixée au support d’injection dans l’œil à travers le trou de guidage à un angle qui évitera la lentille, mais placez la pointe de l’aiguille dans la cavité vitrée.
   8. À l’aide du contrôleur de la micro-pompe à seringue, injectez soigneusement 1 μL d’extrait de Mtb dans la cavité vitrée. En cas de reflux constant, augmenter le volume d’injection à 1,5 μL pour assurer une administration adéquate de la dose.
      note: Pour les contrôles simulés, injecter 1 μL de PBS dans l’œil de l’animal.
   9. Vérifier le placement intravitréen en visualisant un réflexe verdâtre dans l’œil. Reportez-vous à la figure 1F.
   10. Après 10 s, retirez l’aiguille de l’œil. Notez tout reflux.
   11. Retirez la souris de la plate-forme, placez une pommade oculaire à 0,3 % d’hypromellose ou à 0,2 % p/p de carbomère sur les deux yeux pour protéger la cornée, puis passez à la boîte de réchauffement de récupération.
   12. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.
   13. Lorsque la souris est complètement réveillée, retournez dans la cage et ajoutez une bouteille d’eau médicamenteuse à base d’acétaminophène (200-300 mg/kg/jour). Étiquetez la carte de la cage avec la date de l’injection IVT.
   14. Les injections intravitréennes sont généralement bien tolérées. Les signes cliniques qui peuvent indiquer une douleur et la nécessité d’être retiré de l’étude comprennent l’alopécie périoculaire (indiquant un auto-traumatisme), l’ulcération cornéenne, la perte de poids et la posture voûtée.

Figure 1 : Configuration de l’injection intravitréenne chez la souris. L’injection intravitréenne est effectuée sur l’œil de la souris à l’aide (A) d’un contrôleur de micro-pousse-seringue connecté à la (B) Micropompe et (C) d’une seringue d’injection. La seringue est chargée et montée sur la micropompe (D). La tête de la souris est positionnée à l’aide de barres d’oreille (E) pour assurer la stabilité et la cohérence pendant la procédure d’injection intravitréenne. (F) La fluorescéine contenue dans la solution d’injection produit une réflexion verdâtre de l’intérieur de l’œil après une procédure réussie.