Préparation et quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis BCG lux pour l’infection

Résumé

Source : Asai, M. et al., Utilisation de l’invertébré Galleria mellonella comme modèle d’infection pour étudier le complexe Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la préparation et la quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux à l’aide d’un test de bioluminescence et du dénombrement des unités formant des colonies. L’inoculum préparé peut être utilisé pour les études d’infection.

Protocole

REMARQUE : Tous les travaux décrits ci-dessous doivent être effectués dans un laboratoire de NC2 au sein d’une enceinte de sécurité microbiologique (CSM) de classe 2 conformément aux directives locales en matière de santé et de sécurité.

1. Préparation de M. bovis BCG lux pour l’infection

1. Décongeler un stock congelé de 1,2 mL de glycérol (15 %) de M. bovis BCG lux, la souche vaccinale montréalaise transformée avec le plasmide navette pSMT1 portant les gènes luxAB de Vibrio harveyi codant pour l’enzyme luciférase.
2. Inoculer 15 mL de bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol, 10 % d’albumine, de dextrose, d’enrichissement en catalase (ADC) et 50 μg/mL d’hygromycine avec une aliquote décongelée de 1,2 mL de BCG lux, dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL étiquetée.
3. Placer le ballon dans un contenant de biosécurité scellé et incuber à 37 °C dans un incubateur à agitateur orbital à 220 tr/min pendant 72 h (ou jusqu’à ce que la culture atteigne la phase de croissance mi-logarithmique).
4. Vérifiez la croissance de la culture BCG lux en préparant des dilutions 1:10 de la culture dans des tubes de luminomètre à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, tampon phosphate 0,01 M, chlorure de potassium 0,0027 M et chlorure de sodium 0,137 M) en double. Vortex, et chargez les tubes du luminomètre dans le luminomètre et mesurez la bioluminescence (unité de lumière relative [RLU]/mL) en utilisant l’aldéhyde n-décyle comme substrat (1 % v/v dans l’éthanol absolu).
   note: Le rapport entre les UBR/unités formant colonie (UFC) a déjà été déterminé à 3:1 lorsque le BCG lux a été cultivé in vitro dans un bouillon Middlebrook 7H9.
5. Centrifuger la culture à 2 175 x g pendant 10 minutes à température ambiante pour granuler les cellules et jeter le surnageant dans un désinfectant approprié ayant une activité mycobactéricide connue. Jetez tous les déchets de culture avec des désinfectants appropriés pour les mycobactéries en suivant les directives locales.
6. Lavez la pastille cellulaire deux fois dans du PBS contenant 0,05 % de polysorbate 80 (PBS-T) pour éviter l’agglutination bactérienne.
7. Après le lavage final, décantez le surnageant des déchets, remettez en suspension la pastille de cellules mycobactériennes dans du PBS-T et diluez la suspension mycobactérienne à la densité cellulaire souhaitée à l’aide de mesures RLU.
8. Préparer des dilutions en série de dix fois de l’inoculum dans des plaques de 24 puits à l’aide de PBS-T. Déposer 10 μL sur des plaques de gélose Middlebrook 7H11 (0,5 % de glycérol, 50 μg/mL d’hygromycine, 10 % d’acide oléique, d’albumine, de dextrose, de catalase [OADC]) en double pour dénombrer le nombre d’UFC de l’inoculum.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de réaction de 1,5 ml (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
Pipette de 20, 200 et 1000 μl et pointes filtrées	Tout fournisseur	n/a
Plaque de culture à 24 puits	Greiner	Référence 662160
Pipettes de 25 ml et pipette boy	Tout fournisseur	n/a
Boîte de Pétri à 3 compartiments (94/15mm)	Greiner	637102
centrifugeuse	Tout fournisseur	n/a
Armoire de sécurité de classe II	Tout fournisseur	n/a
Éthanol (>99,7 %)	VWR	Référence 208221.321
glycérol	Sigma-Aldrich	G5150
Hygromycine B	Corning	30 à 240CR
Luminomètre (Autolumat LB 953)	Berthold	Référence 34622
Tubes luminomètres	Corning	352054
Microcentrifugeuse	Tout fournisseur	n/a
Gélose Middlebrook 7H11	BD Biosciences	Référence 283810
Bouillon Middlebrook 7H9	BD Biosciences	Référence 271310
Enrichissement de l’ADC de Middlebrook	BD Biosciences	212352
Enrichissement de l’OADC de Middlebrook	BD Biosciences	Référence 212240
Mycobacterium bovis BCG lux	divers	n/a
n-décylaldéhyde	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Incubateur à secousses orbitales	Tout fournisseur	n/a
Saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
Erlenmeyer avec bouchon ventilé (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (V1.08)	Berthold	n/a	Programme LB953.TTB