REMARQUE : Tous les travaux décrits ci-dessous doivent être effectués dans un laboratoire de NC2 au sein d’une enceinte de sécurité microbiologique (CSM) de classe 2 conformément aux directives locales en matière de santé et de sécurité.
1. Préparation de M. bovis BCG lux pour l’infection
- Décongeler un stock congelé de 1,2 mL de glycérol (15 %) de M. bovis BCG lux, la souche vaccinale montréalaise transformée avec le plasmide navette pSMT1 portant les gènes luxAB de Vibrio harveyi codant pour l’enzyme luciférase.
- Inoculer 15 mL de bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol, 10 % d’albumine, de dextrose, d’enrichissement en catalase (ADC) et 50 μg/mL d’hygromycine avec une aliquote décongelée de 1,2 mL de BCG lux, dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL étiquetée.
- Placer le ballon dans un contenant de biosécurité scellé et incuber à 37 °C dans un incubateur à agitateur orbital à 220 tr/min pendant 72 h (ou jusqu’à ce que la culture atteigne la phase de croissance mi-logarithmique).
- Vérifiez la croissance de la culture BCG lux en préparant des dilutions 1:10 de la culture dans des tubes de luminomètre à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, tampon phosphate 0,01 M, chlorure de potassium 0,0027 M et chlorure de sodium 0,137 M) en double. Vortex, et chargez les tubes du luminomètre dans le luminomètre et mesurez la bioluminescence (unité de lumière relative [RLU]/mL) en utilisant l’aldéhyde n-décyle comme substrat (1 % v/v dans l’éthanol absolu).
note: Le rapport entre les UBR/unités formant colonie (UFC) a déjà été déterminé à 3:1 lorsque le BCG lux a été cultivé in vitro dans un bouillon Middlebrook 7H9.
- Centrifuger la culture à 2 175 x g pendant 10 minutes à température ambiante pour granuler les cellules et jeter le surnageant dans un désinfectant approprié ayant une activité mycobactéricide connue. Jetez tous les déchets de culture avec des désinfectants appropriés pour les mycobactéries en suivant les directives locales.
- Lavez la pastille cellulaire deux fois dans du PBS contenant 0,05 % de polysorbate 80 (PBS-T) pour éviter l’agglutination bactérienne.
- Après le lavage final, décantez le surnageant des déchets, remettez en suspension la pastille de cellules mycobactériennes dans du PBS-T et diluez la suspension mycobactérienne à la densité cellulaire souhaitée à l’aide de mesures RLU.
- Préparer des dilutions en série de dix fois de l’inoculum dans des plaques de 24 puits à l’aide de PBS-T. Déposer 10 μL sur des plaques de gélose Middlebrook 7H11 (0,5 % de glycérol, 50 μg/mL d’hygromycine, 10 % d’acide oléique, d’albumine, de dextrose, de catalase [OADC]) en double pour dénombrer le nombre d’UFC de l’inoculum.
2. Préparation des larves de G. mellonella
- Achetez les larves du dernier stade auprès de sources appropriées et maintenez-les dans l’obscurité à 18 °C à leur arrivée et utilisez-les dans la semaine suivant l’achat. Alternativement, les larves peuvent être auto-élevées selon le protocole de Jojāo et al. Pour les larves achetées, jetez toutes les larves mortes, décolorées ou en train de se nymphoser avant de les stocker.
note: Les larves en nymphose se distinguent morphologiquement des larves du dernier stade.
- Identifier et sélectionner des larves saines à des fins d’expérimentation, en fonction de leur couleur crème uniforme avec peu ou pas de décoloration (mélanisation), de leur taille (2 à 3 cm de longueur), de leur poids (environ 250 mg), de leur motilité élevée et de leur capacité à se redresser lorsqu’elles sont retournées.
- Comptez soigneusement les larves saines (minimum de 20 à 30 par groupe) dans une boîte de Pétri (94/15 mm) recouverte d’une couche de papier filtre (94/15 mm) à l’aide d’une pince à épiler à bout émoussé pour minimiser la contamination et conservez-la à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à utilisation.
3. Infecter G. mellonella avec BCG lux
- Minimisez l’encombrement à l’intérieur du CSM afin de réduire le risque de contamination et de blessures par piqûre d’aiguille.
- Préparez la plate-forme d’injection en collant un papier filtre circulaire (94 mm) sur une surface plane en relief. Des surfaces souples ou dures peuvent être utilisées et dépendent entièrement des préférences de l’utilisateur, par exemple, des couvercles de boîte à pipette ou une éponge à récurer en nylon.
- Stérilisez une microseringue de 25 μL (25 G) en aspirant 3 volumes d’éthanol à 70 % et rincez ensuite avec 3 volumes de PBS-T stérile.
- Aspirer 10 μL d’inoculum BCG lux (préparé dans la section 1) ou de PBS-T dans la microseringue stérilisée de 25 μL. Utilisez une seringue séparée pour le contrôle négatif PBS-T.
note: Remettre en suspension l’inoculum BCG lux après 10 injections pour assurer une suspension cellulaire uniforme.
- À l’aide d’une pince à épiler, prélevez une larve et placez-la sur la plateforme d’injection.
- Sur la plate-forme, retournez la larve sur le dos et immobilisez-la en fixant la tête et la queue à l’aide d’une pince à épiler. Repérez la dernière patte gauche à partir de la tête de la larve et insérez soigneusement la pointe de l’aiguille (5−6 mm) à un angle de 10−20° par rapport au plan horizontal.
note: Les pinces à épiler courtes et étroites permettent une immobilisation facile avec un minimum de stress larvaire. Faites attention à ne pas trop pénétrer, ce qui pourrait perforer l’intestin et provoquer une mélanisation ou la mort non spécifique du BCG lux.
- Comptez les larves infectées dans une boîte de Pétri recouverte d’une couche de papier filtre, une seule boîte de Pétri de 90 mm peut accueillir jusqu’à 30 larves.
- Conservez la boîte de Pétri contenant les larves dans une boîte sombre ventilée ou non scellée à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
4. Surveillance de la survie de G. mellonella après une infection
- Au cours de la période, surveillez la survie des larves toutes les 24 heures. Les larves sont considérées comme mortes lorsqu’elles ne bougent pas en réponse au toucher.
