Quantification de la charge d’Helicobacter pylori dans l’estomac d’une souris infectée

Résumé

Source : D'Costa, K. et al., Modèles murins d'infection à Helicobacter et de pathologies gastriques. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant de quantifier la charge d’Helicobacter pylori dans les tissus de l’estomac de souris après l’infection afin de confirmer sa colonisation.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Confirmation de la colonisation bactérienne dans l’estomac après l’infection

1. Dénombrement viable de H. pylori dans l’estomac
   1. Complétez les plaques d’AHB stériles avec des antibiotiques supplémentaires (200 μg/mL de bacitracine et 10 μg/mL d’acide nalidixique) avant d’effectuer le dénombrement des colonies à partir de l’estomac de souris infectées.
   2. Homogénéiser les sections de l’estomac soit manuellement, à l’aide de micro-pilons en polypropylène autoclavables, soit à l’aide d’un instrument de dissociation mécanique (voir tableau des matériaux).
   3. Préparer des dilutions en série dupliquées (10⁻¹ à 10⁻²) des homogénats gastriques résultants dans des BHI.
      note: Les dilutions doivent être décidées en fonction des charges bactériennes typiques obtenues pour une souche donnée de H. pylori utilisée pour l’infection, ainsi que de la durée de l’infection. Des échantillons non dilués peuvent également être utilisés.
   4. Divisez les plaques d’AHB préséchées (REMARQUE : Afin d’assurer l’isolement des colonies individuelles, les plaques d’AHB doivent être réchauffées et séchées dans une enceinte de sécurité biologique ou un incubateur à 37 °C pendant 10 à 15 minutes avant d’être utilisées) en trois ou quatre segments. À l’aide d’une adaptation de la technique de Miles et Misra, ajouter 10 à 100 ml de chaque dilution sur un segment de la plaque de gélose et étaler à l’aide de boucles en plastique stériles.
   5. Laissez sécher les assiettes, puis placez-les en position inversée (couvercle vers le bas) dans des bocaux de gaz anaérobies. Pour maintenir l’humidité dans les bocaux, incluez une boîte de Pétri contenant de l’eau.
   6. Incuber les bocaux à 37 °C jusqu’à ce que des colonies se forment (généralement de 4 à 7 jours).
   7. Énumérer le(s) segment(s) contenant entre 10 et 100 colonies isolées.
      REMARQUE : Les colonies de H. pylori et la croissance de H. felis sur les plaques peuvent être distinguées de celles des autres membres du microbiote gastrique murin à l’aide des tests standard d’uréase, de catalase et d’oxydase. H. pylori et H. felis sont positifs pour les trois tests.
   8. Calculez les charges bactériennes en (UFC/g de tissu), en utilisant la formule suivante :
      [(Nombre moyen de colonies comptées) × (facteur de dilution) x (volume plaqué)]/(poids de l’estomac).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs bactériologiques
Base d’agar de sang oxoïde n ° 2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Dissoudre dans l’eau désinonisée avant la stérilisation
Sang de cheval défibriné de qualité supérieure	Produits biologiques éthiques australiens	PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Bouillon	BD Biosciences	Référence 237500	Dissoudre dans l’eau désinonisée avant la stérilisation
Packs de gaz CampyGen	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Antibiotiques
Vancomycine	Sigma Aldrich	V2002-1G	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Polymyxine B	Sigma Aldrich	Réf. P4932-5MU	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Triméthoprime (≥98 % HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Dissoudre dans de l’éthanol à 100 % (absolu)
amphotéricine	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Bacitracine de Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	Réf. B0125	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Acide naladixique	Sigma Aldrich	N° N8878	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Équipement et articles en plastique
Bocaux anaérobies oxoïdes	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
Pipettes COPAN Pasteur	Services Interpath	Référence 200CS01
Centrifugeuse Eppendorf 5810R			Recueillir les granulés bactériens par centrifugation à 2 200 tr/min pendant 10 min à 4 °C
Parafilm M	Bemis, VWR	Réf. PM996
Micropilon Eppendorf pour tubes de 1,2 à 2 mL	Sigma Aldrich	Z317314	Pilons en polypropylène autoclavables utilisés pour l’homogénéisation de l’estomac
Dissociateur GentleMACs	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-235	Utilisez un programme softMACS prédéfini pour les tissus de l’estomac de souris
Tubes M (bouchon orange)	Miltenyi Biotec	Référence : 30-093-236
Fluorimètre Qubit	Thermo Fischer Scientific	Question n°33216
Boucle en plastique stérile	LabServ	LBSLP7202