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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cathéters
- Préparez une canule pédiatrique d’accès intraveineux pour chaque groupe de souris à infecter. À l’aide du mécanisme à ressort intégré, déposez chaque canule de son aiguille, selon les instructions du fabricant. Jetez les aiguilles, en ne conservant que la canule intraveineuse en plastique.
- Stérilisez les cathéters dans une hotte à flux laminaire pour un cycle ultraviolet (U.V.), généralement de 25 à 30 min
Remarque : Les cathéters peuvent être utilisés pour plus d’une souris, cependant, un nouveau cathéter doit être utilisé entre les groupes expérimentaux, les sexes ou les souches bactériennes.
2. Préparation d’E. coli uropathogène pour l’infection
- Au moins deux jours avant l’infection, à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, striez l’UPEC d’un stock bactérien congelé sur une plaque de gélose Luria Broth (LB), contenant des antibiotiques si nécessaire. Incuber à 37 °C pendant la nuit. Les plaques peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à une semaine.
- Dans un erlenmeyer stérile de 100 ml, inoculer 10 ml de LB, contenant des antibiotiques si nécessaire, avec une seule colonie de la plaque LB et incuber à 37 °C pendant la nuit (environ 16 à 18 heures).
Remarque : Les cultures sur pied permettent l’expression des pili de type 1, qui sont nécessaires à l’infection. Les cultures cultivées en secouant auront une expression moins efficace des pili et, par conséquent, des taux d’infection incohérents.
- Mesurez la densité optique (OD)600 de la culture de nuit et calculez le nombre de bactéries par ml à l’aide d’une courbe de croissance prédéterminée. À titre d’exemple, pour la souche UTI89 de l’UPEC, une DO600 = 0,35 équivaut à 2 x 108 UFC par ml, par conséquent, une culture de nuit avec une DOde 600 = 2,4 équivaudrait à 13,7 x 108 UFC par ml. Déterminer empiriquement la relation entre l’OD600 et les bactéries viables avec chaque nouvelle souche utilisée pour l’infection.
- Déterminer la quantité de bactéries nécessaire en tenant compte du nombre d’animaux à infecter et du fait que chaque souris devrait recevoir environ 107 unités formant colonies (UFC) dans 50 μl de PBS. Incluez dans le calcul le volume mort de ~130 μl du cathéter et de la tige de la seringue et les 100 μl nécessaires pour déterminer l’inoculum.
- Faites tourner la suspension bactérienne dans une microcentrifugeuse de table à 17 000 x g pendant 1 min et remettez en suspension la pastille bactérienne résultante à 2 x10,8 UFC par ml dans du PBS. Diluez en série une aliquote de cette suspension et plaquez-la sur de la gélose LB, avec des antibiotiques si nécessaire, pour déterminer l’inoculum exact pour chaque infection.
- Prélevez l’inoculum bactérien dans une seringue de 1 ml et fixez le cathéter à l’extrémité de la seringue. Tapotez la seringue pour éliminer l’air et appuyez sur le piston pour remplir l’espace d’air mort dans le cathéter avant de commencer l’instillation.
3. Préparation des souris
- Anesthésie les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 5 mg/kg de xylazine. Une chaleur supplémentaire peut être fournie.
- Assurez-vous que chaque souris est complètement sous sédatif en pressant le repose-pieds avec une pression moyenne. Les souris sont complètement sous sédation lorsqu’elles ne réagissent pas et ont besoin de 3 à 5 minutes pour atteindre cet état.
- Placez les souris en décubitus dorsal et appliquez une pression moyenne sur le bas-ventre pour vider la vessie de l’urine. Les vessies pleines ressemblent à un pois sous la peau entre les crêtes iliaques.
Remarque : L’isoflurane inhalé a été utilisé pour cathétériser des souris femelles, cependant, il n’a pas été testé si les souris mâles sont suffisamment anesthésiées par l’isoflurane inhalé pour cette procédure.
4. Instillation transurétrale de souris mâles
- Placez deux pinces à pouce crânienne et caudale sur les organes génitaux externes de la souris. Rétractez le prépuce pour exposer complètement le gland du pénis. Une fois que le pénis est positionné à l’extérieur, relâchez la pince à pouce.
- Repositionnez la pince pour stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, en tenant l’organe doucement mais tendu. Visualisez le méat urétral et introduisez soigneusement le cathéter dans la petite ouverture à l’extrémité de l’organe. Guidez doucement le cathéter dans le pénis, vers le corps de la souris, en maintenant une légère tension avec la pince. Le cathéter ne nécessite aucune lubrification. Ne forcez pas le cathéter dans le pénis ; Le cathéter doit glisser en douceur dans l’urètre, indiquant le bon placement.
- Une fois que le moyeu du cathéter rencontre l’extrémité du pénis, distribuez très lentement 50 μl de l’inoculum, tout en maintenant la position du pénis. La qualité de l’instillation peut être notée à ce moment en fonction d’un score de qualité d’instillation prédéterminé, tel que celui illustré à la figure 1.
- Rétractez le cathéter lentement, en comptant jusqu’à 5, pour éviter la fuite de l’inoculum. Placez les souris dans leurs cages en position couchée. Les animaux devraient commencer à récupérer 30 à 45 minutes après l’administration de l’anesthésique.
