Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cathéters
- Préparez une canule pédiatrique d’accès intraveineux pour chaque groupe de souris à infecter. À l’aide du mécanisme à ressort intégré, déposez chaque canule de son aiguille, selon les instructions du fabricant. Jetez les aiguilles, en ne conservant que la canule intraveineuse en plastique.
- Stérilisez les cathéters dans une hotte à flux laminaire pour un cycle ultraviolet (U.V.), généralement de 25 à 30 min
note: Les cathéters peuvent être utilisés pour plus d’une souris, cependant, un nouveau cathéter doit être utilisé entre les groupes expérimentaux, les sexes ou les souches bactériennes.
2. Préparation d’Escherichia coli uropathogène pour l’infection
- Au moins deux jours avant l’infection, à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, striez Escherichia coli uropathogène (UPEC) d’un stock bactérien congelé sur une plaque de gélose Luria Broth (LB), contenant des antibiotiques si nécessaire. Incuber à 37 °C pendant la nuit. Les plaques peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à une semaine.
- Dans un erlenmeyer stérile de 100 ml, inoculer 10 ml de LB, contenant des antibiotiques si nécessaire, avec une seule colonie de la plaque LB et incuber à 37 °C pendant la nuit (environ 16 à 18 heures).
note: Les cultures sur pied permettent l’expression des pili de type 1, qui sont nécessaires à l’infection. Les cultures cultivées en secouant auront une expression moins efficace des pili et, par conséquent, des taux d’infection incohérents.
- Mesurez la densité optique (OD)600 de la culture de nuit et calculez le nombre de bactéries par ml à l’aide d’une courbe de croissance prédéterminée. À titre d’exemple, pour la souche UTI89 d’UPEC, une DO600 = 0,35 équivaut à 2 x 108 unités formant une colonie (UFC) par ml, par conséquent, une culture de nuit avec une DOde 600 = 2,4 équivaudrait à 13,7 x 108 UFC par ml. Déterminer empiriquement la relation entre l’OD600 et les bactéries viables avec chaque nouvelle souche utilisée pour l’infection.
- Déterminer le nombre de bactéries nécessaires en tenant compte du nombre d’animaux à infecter et du fait que chaque souris devrait recevoir environ 10à 7 unités formant colonies (UFC) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 50 μl. Incluez dans le calcul le volume mort de ~130 μl du cathéter et de la tige de la seringue et les 100 μl nécessaires pour déterminer l’inoculum.
- Faites tourner la suspension bactérienne dans une microcentrifugeuse de table à 17 000 x g pendant 1 min et remettez en suspension la pastille bactérienne résultante à 2 x10,8 UFC par ml dans du PBS. Diluez en série une aliquote de cette suspension et plaquez-la sur de la gélose LB, avec des antibiotiques si nécessaire, pour déterminer l’inoculum exact pour chaque infection.
- Prélevez l’inoculum bactérien dans une seringue de 1 ml et fixez le cathéter à l’extrémité de la seringue. Tapotez la seringue pour éliminer l’air et appuyez sur le piston pour remplir l’espace d’air mort dans le cathéter avant de commencer l’instillation.
3. Préparation des souris
- Anesthésie les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 5 mg/kg de xylazine. Une chaleur supplémentaire peut être fournie.
- Assurez-vous que chaque souris est complètement sous sédatif en pressant le repose-pieds avec une pression moyenne. Les souris sont complètement sous sédation lorsqu’elles ne réagissent pas et ont besoin de 3 à 5 minutes pour atteindre cet état.
- Placez les souris en décubitus dorsal et appliquez une pression moyenne sur le bas-ventre pour vider la vessie de l’urine. Les vessies pleines ressemblent à un pois sous la peau entre les crêtes iliaques.
note: L’isoflurane inhalé a été utilisé pour cathétériser des souris femelles, mais il n’a pas été testé si les souris mâles sont suffisamment anesthésiées par l’isoflurane inhalé pour cette procédure.
4. Instillation transurétrale de souris femelles
- À l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la même main sur l’abdomen de la souris et appliquez une légère pression dans des directions opposées pour maintenir la souris fermement en place.
- Placez l’extrémité du cathéter perpendiculairement à la souris au niveau de l’orifice urétral. Avec une légère pression, glissez le cathéter dans l’urètre, jusqu’à ce que le moyeu rencontre l’orifice urétral, tout en abaissant simultanément la seringue de manière à ce qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Le cathéter ne nécessite aucune lubrification. Ne poussez pas et ne forcez pas le cathéter dans l’urètre. Le cathéter doit glisser en douceur et facilement dans l’urètre, avec peu ou pas de résistance.
- Avant d’instiller l’inoculum (étape 4.3), une fois le cathéter en place, tirez très doucement la peau abdominale vers la tête de la souris avec le doigt de la main non dominante qui se trouve déjà sur l’abdomen de la souris (étape 4.1). Si le cathéter est dans l’urètre, le tissu composant l’orifice de l’urètre ne bougera pas, tandis que si le cathéter est mal placé dans le vagin, le tissu se déplacera vers le haut et s’éloignera du cathéter. Ce test rapide doit être effectué sur chaque souris.
- Lorsque le moyeu du cathéter rencontre l’orifice urétral, distribuez lentement 50 μl de l’inoculum bactérien. Un taux d’instillation lent minimise le reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirez lentement le cathéter pour éviter les fuites, en comptant jusqu’à 5. Placez les souris dans leurs cages en position couchée.
