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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Analyse par cytométrie en flux du tissu vésical
- Préparez un tampon de digestion contenant de la collagénase à 34 unités/mL et de la DNase à 100 μg/mL, dans du PBS. Restez sur la glace. Préparer un tube conique de 15 ml par animal à analyser et aliquote 1 ml de tampon de digestion par tube.
- À des moments prédéterminés, sacrifiez les souris en utilisant des procédures opératoires standard approuvées (par exemple, luxation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifiez soigneusement l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % pour minimiser la contamination par la fourrure.
- Faites une incision d'au moins 2 cm dans le tiers inférieur de l'abdomen de la souris à l'aide de ciseaux et retirez toute la vessie. Hachez bien avec des ciseaux, en coupant la vessie en morceaux de 2 à 3 mmde 2 tailles, généralement environ 8 morceaux.
- Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de digestion. Secouez pour laver le tissu de la vessie haché dans le tampon de digestion. Garder sur la glace jusqu’à ce que toutes les vessies soient disséquées et hachées.
- Incuber des vessies hachées pendant 60 à 75 min à 37 °C, en secouant vigoureusement à la main pendant 5 s toutes les 15 min. Lorsque le tissu a un aspect transparent vitreux, ressemblant à du papier de soie humide, la digestion est complète. Une digestion prolongée éliminera les protéines de surface des cellules nécessaires à l’identification et doit être évitée.
- Inactiver les enzymes de digestion en ajoutant 2 à 3 mL de tampon de cytométrie en flux glacé (PBS contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,2 mM d’EDTA) et mélanger doucement. Placez les tubes sur de la glace.
- Pour assurer une suspension unicellulaire et pour éliminer tout tissu conjonctif, passez le contenu du tube à travers un filtre de 100 μm placé dans un tube conique de 15 mL. Pressez doucement tout tissu restant à travers le filtre avec l’extrémité d’un piston de seringue. Lavez le filtre avec un tampon de cytométrie en flux supplémentaire de 2 ml. Conservez les échantillons sur de la glace.
- Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 °C. Remettre les granules en suspension dans un tampon de cytométrie en flux de 100 μL contenant un bloc Fc, dilué à 5 μg/mL, et transférer sur une plaque à fond rond à 96 puits. Après 10 à 15 minutes, ajoutez 100 μL de cocktail d’anticorps souhaité à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30 à 45 min, sur de la glace, à l’abri de la lumière.
note: Le bloc Fc est un réactif utilisé pour empêcher la liaison de la partie Fc des anticorps aux cellules exprimant les récepteurs Fc. Son but est de minimiser la liaison d’anticorps non spécifiques. La détermination des anticorps à utiliser dépendra de l’hypothèse testée dans l’expérience et devrait être sélectionnée en tenant compte de la littérature. Dans la figure 1, pour mesurer l’infiltration globale des cellules immunitaires, un anticorps anti-CD45 a été utilisé, qui est une protéine cellulaire pan-immune.
- Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 °C. Remettre les granules de cellules en suspension dans un tampon de cytométrie en flux de 200 μL et faire passer les échantillons à travers une crépine cellulaire de 40 μm sur un tube en polystyrène de 5 ml juste avant l’acquisition sur un cytomètre en flux.
- Prélever l’échantillon entier sur le cytomètre en flux. Une bonne digestion produira 200 000 à 400 000 cellules, avec 8 000 à 10 000 cellules immunitaires CD45+ provenant de vessies de souris naïves, tandis que les organes infectés contiendront plus de cellules (Figure 1).
note: Les échantillons préparés pour l’analyse cytométrique en flux ne peuvent pas être utilisés pour évaluer l’UFC. Il n’est pas recommandé de diviser la vessie en deux parties, car il n’existe aucune preuve démontrant que la colonisation uropathogène par E. coli (UPEC) ou l’infiltration de cellules immunitaires est uniforme dans tout le tissu.
