Technique permettant d’établir un modèle d’infection bactérienne dans une culture d’organe ex vivo

Résumé

Source : Rizzuto, G. A., et al. Cultures d’organes placentaires et déciduals humains pour étudier les infections à l’interface mère-fœtus. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir un modèle d’infection dans les tissus placentaires pour étudier la propagation de l’infection. Une culture d’organe placentaire ex vivo est infectée par Listeria monocytogenes, un parasite intracellulaire facultatif. Les bactéries envahissent les trophoblastes extravilleux (TEV) pour pénétrer dans le tissu placentaire, puis se propagent à d’autres cellules par propagation de cellule à cellule.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation des plaques de culture d’organes

REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire. Il est idéal pour le microscope de dissection d’être situé dans un champ stérile. Cependant, ce n’est pas absolument nécessaire tant que la micro-dissection est effectuée rapidement et que les instruments sont fréquemment trempés dans de l’éthanol à 70 %.

1. Décongeler les flacons de matrice extracellulaire (MEC) sur de la glace. Diluez l’ECM 1:1 avec un milieu de collecte glacé et mélangez par pipetage. Pipetez lentement pour éviter d’introduire des bulles. Chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits nécessite 100 μl de cette suspension et peut accueillir 3 à 4 cultures d’organes.
2. Placez des inserts transwell (taille des pores de 0,4 μM) dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire à 6 puits.
3. Enduire chaque insert transwell d’une fine couche (100 μl) de suspension ECM/média.
4. Placez la plaque sur de la glace et procédez immédiatement à l’établissement des cultures d’organes. Vous pouvez également préparer la plaque avant le prélèvement des tissus, auquel cas enveloppez-la dans un film parafilm et conservez-la à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Un stockage de plus de 6 heures n’est pas recommandé car l’ECM se dessèchera.

2. Mise en place des cultures d’organes

REMARQUE : Cette étape décrit comment placer les cultures d’organes déciduales et les cultures d’organes villeuses dans des puits de transfusion séparés. Les tissus ne sont pas en contact. Les chercheurs intéressés par une technique de co-culture où les décidua et les villosités sont en contact direct les unes avec les autres peuvent se référer à la littérature antérieure.

1. Rincer les échantillons deux fois dans un milieu de collecte et centrifuger à 1 000 x g entre chaque rinçage. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile et placez-le sur la platine d’un microscope de dissection. Conservez une plaque à 6 puits sur de la glace à côté du microscope.
2. Micro-disséquer des tissus à l’aide de ciseaux de dissection à ressorts stériles et de pinces, afin d’établir des cultures d’organes villeux de 2 à 3 mm (Figure 1A).
   note: Les cultures d’organes villeux sont de petits « arbres » bien vascularisés à 2 ou 3 branches et dotés de colonnes de cellules trophoblastiques extravilleuses (EVT) proéminentes. Il est important de n’utiliser que du tissu villeux à partir d’échantillons de <9 semaines du premier trimestre, car l’invasion de trophoblastes extravillositaires dans la MEC est plus prononcée à ces jeunes âges.
3. Sélectionnez des villosités bien vascularisées avec des colonnes de cellules EVT proéminentes. Les colonnes des cellules EVT sont visualisées comme des extrémités bulbeuses, « floues », « duveteuses » (voir les pointes de flèche de la figure 1A).
4. À l’aide d’une pince stérile, transférez 3 ou 4 villosies dans chaque puits de transversation. Ajustez les branches de manière à ce que l’arbre soit positionné à plat sur le sommet de l’ECM et séparez les branches groupées.
5. Micro-dissection de tissu décidual à l’aide de ciseaux de dissection à ressorts stériles et de pinces, afin d’établir des cultures d’organes déciduals de 3 mm³ (Figure 1A).
   note: Les échantillons contiennent deux types distincts de tissus déciduals, la décidua parietalis et la decidua capsularis (fragments de tissus gauche et droit, respectivement, figure 1A).
6. Coupez avec des ciseaux pour créer 3 mm³ morceaux de decidua parietalis. Decidua capsularis n’est pas utilisé pour ces cultures. Utilisez des pinces pour extraire tout sang maternel coagulé.
7. À l’aide d’une pince stérile, transférez 3 à 4 morceaux de décidua dans chaque transpuits.
8. Ajouter 1 ml de milieu de collecte au fond du puits. Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 °C dans 5 % de CO₂.
9. Pour les expériences où il est important d’imiter la tension normale de l’oxygène placentaire du premier trimestre, maintenir les cultures d’organes villeux en hypoxie relative (3 % O₂).
   note: Les options de laboratoire comprennent de petites chambres d’incubation d’hypoxie qui s’insèrent à l’intérieur des incubateurs existants ou un incubateur trigaz qui introduit un gaz_N2 externe pour réduire la concentration d’oxygène.
10. Ajouter 1 ml de milieu villeux ou décidual (tableau 1) sur le dessus du puits après 12 à 16 heures de culture.
    note: L’absence de milieu pendant la première nuit en culture permet aux colonnes de cellules trophoblastiques extravillositaires d’envahir (culture villositaire) et aux tissus (villeux et déciduels) de s’intégrer solidement dans la MEC. D’après notre expérience, les cultures d’organes déciduales restent viables pendant 72 heures et les cultures d’organes villeux pendant 96 heures. Nous recommandons des paramètres expérimentaux qui se situent dans cette période. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu villeux et décidual. Le milieu villeux a un pourcentage élevé de FBS, tandis que le milieu décidual est complété par des hormones de grossesse (progestérone, 17β-œstradiol) qui maintiennent l’état décidualisé (tableau 1).

3. Préparation des cultures de L. monocytogenes

REMARQUE : Pour un protocole détaillé sur le stockage à long terme de L. monocytogenes, ainsi que sur la culture et la croissance de cet organisme dans un bouillon de perfusion cerveau-cœur (BHI) et une gélose, veuillez vous référer à Wang et al.

1. Prélever une seule colonie de L. monocytogenes dans une plaque de gélose BHI striée et inoculer 3 ml de bouillon BHI.
2. Incuber la culture de L. monocytogenes pendant la nuit (16 heures), en position inclinée, à 30 °C
   note: Ces conditions de culture permettent à la croissance bactérienne d’atteindre la phase stationnaire. L. monocytogenes est flagellé à 30 °C, ce qui augmente l’invasion des cellules hôtes.

4. Infection des cultures d’organes par L. monocytogenes

1. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) chaude et milieu villeux ou décidual (tableau 1) à 37 °C.
2. Utilisez une pince à épiler stérile pour retirer tous les morceaux de culture d’organes qui n’ont pas envahi l’ECM et qui flottent donc dans le puits.
3. Aspirez soigneusement le fluide par le bas du puits de transbordement. Rincer deux fois les transpuits supérieur et inférieur en pipetant doucement 1 ml de PBS chaud dans le puits et en aspirant soigneusement entre les deux. Pipetez doucement 1 ml de milieu villeux ou décidual exempt d’antibiotique sur le puits supérieur et inférieur. Attention à ne pas perturber la culture de l’organe.
4. Laissez le tissu incuber dans un milieu sans antibiotiques pendant au moins une heure pour vous assurer que les antibiotiques ont été éliminés.
   note: À la phase stationnaire, la densité de la culture de L. monocytogenes est d’environ 1 x 10⁹ unités formant colonies (UFC) par ml. Le nombre de bactéries utilisées pour infecter les cultures d’organes doit être déterminé empiriquement pour répondre aux besoins expérimentaux.
5. Pour les infections à L. monocytogenes de type sauvage, les expériences de routine montrent une invasion robuste avec une dilution de 1:50 de la nuit (4 x 10⁷ L. monocytogenes dans 1 ml de milieu par puits). Remettez en suspension le nombre approprié de bactéries dans un milieu villeux ou décidual exempt d’antibiotiques.
6. Aspirer le fluide par le haut des transwells. Ajouter délicatement 1 ml d’inoculum. Incuber les plaques à 37 °C dans 5 % de CO₂ pour permettre l’invasion bactérienne.
7. Éliminez les bactéries extracellulaires en aspirant les fluides des puits supérieurs et inférieurs. Rincez bien deux fois avec du PBS chaud. Ajouter 1 ml de milieu villeux ou décidual complété par 50 μg ^ml-1 de gentamicine. Incuber les plaques à 37 °C dans 5 % CO₂.
   REMARQUE : L. monocytogenes est une bactérie intracellulaire facultative qui peut se développer dans un milieu extracellulaire, se développer à l’intérieur des cellules et se propager d’une cellule à l’autre sans accéder à l’espace extracellulaire. La gentamicine a un effet bactéricide sur L. monocytogenes extracellulaire, et permet ainsi de mesurer la croissance intracellulaire de L. monocytogenes et sa propagation à travers la culture d’organes.
   note: L’infection reproductible à L. monocytogenes des cultures d’organes villeuses et décidues se produit avec des temps d’incubation de 5 heures. Le temps d’incubation avant l’ajout de gentamicine peut être modifié en fonction des besoins expérimentaux et de la capacité de l’organisme à envahir les tissus. Pour mieux comprendre les sites anatomiques les plus vulnérables à l’infection, des temps d’incubation plus courts peuvent être utilisés.
8. Maintenir les plaques à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant toute la durée de l’expérience. Changez l’ensemble du média dans chaque puits tous les jours.
   note: D’après notre expérience, les cultures d’organes déciduales infectées par L. monocytogenes restent viables pendant 48 heures et les cultures d’organes villeuses pendant 72 heures.

Tableau 1 : Recettes multimédias. Composants et concentrations pour la préparation du tampon de lavage, du milieu de collecte, du milieu villeux et du milieu décidual

Tampon de lavage	Support de collection	Milieu villeux	Décidule moyenne
Pbs	DMEM/F-12 avec GlutaMAX	DMEM/F-12 avec GlutaMAX	DMEM/F-12 avec GlutaMAX
Pénicilline 100 UI/ml	Sérum fœtal bovin 2,5 %	Sérum fœtal bovin 20 %	Sérum fœtal bovin 2,5 %
Streptomycine 100 μg/ml	Pénicilline 100 UI/ml	Pénicilline 100 UI/ml	17β-œstradiol 300 pg/ml
Gentamicine 50 μg/ml	Streptomycine 100 μg/ml	Streptomycine 100 μg/ml	Progestérone 20 ng/ml
Amphotéricine B 1,25 μg/ml	Gentamicine 50 μg/ml
	Amphotéricine B 1,25 μg/ml

Résultats

Figure 1 : Cultures d’organes villeux – Images grossières et microscopiques représentatives.

(A) Deux villosités terminales avec un âge gestationnel de 6 semaines, vues au microscope de dissection. Notez les extrémités « duveteuses » (pointes de flèches) et le système vasculaire fœtal proéminent qui traverse les branches de l’arbre ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sachets de stérilisation	Fisher Scientific	Tél. : 01-812-54	Pour l’autoclave d’outils de dissection individuels
Passoire à mailles fines	Cuisinart (Amazon.com)	Na	Envelopper complètement dans du papier d’aluminium et de l’autoclave avant de prélever les tissus.
Bonbonne avec robinet	Fisher Scientific	Tél. : 03-007-647	Pour la préparation de grands volumes de tampon de lavage.
Glace	Laboratoires Nortech	Référence : 8818	Il n’est pas nécessaire de les acheter, mais ils peuvent être recyclés/réutilisés à partir de tout envoi de laboratoire de routine qui les inclut dans l’emballage.
70 % d’éthanol	VWR	V1001	Solution à 70 % obtenue en ajoutant du dH20 à de l’alcool de recherche à 190 ou 200 degrés.
10 % Eau de Javel	Cirie Approvisionnement Sanitaire	CLO 30966	Solution à 10 % obtenue par ajout de dH20.
Caisson lumineux	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Notez les ampoules de rechange également achetées sur Blick (55305.0100)
Micro pince à dissection	Stoelting	Référence 52102-43	4 pouces, 1x2 0,5 mm, légère courbe
Micro pince à dissection	Stoelting	Référence 52102-06	4 pouces, droit, fin, pointu
Micro dissection vannes ciseaux à ressort	Stoelting	Référence 52130-01P	Ciseaux à ressort McPherson-Vannas, 8,5 cm, pointe 0,33, légère courbe
Microscope de dissection	Microsystèmes Leica	MZ16 ou M60	Nous avons eu du succès avec les modèles énumérés. Les sources lumineuses externes flexibles en col de cygne sont utiles mais pas nécessaires.
Tubes coniques de 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Saline tamponnée au phosphate	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Nous achetons auprès de notre centre de culture tissulaire universitaire, d’autres options comme celle-ci sont disponibles.
10X Saline tamponnée au phosphate	Teknova	Réf. P0195	Pour la préparation du tampon de lavage, nous utilisons 10X PBS
Mélange nutritif DMEM/F-12 (jambon) avec GlutaMAX	Gibco (Life Technologies)	Référence 10565-018	Nous achetons cette formulation de milieu spécifique, contenant 2,438 g/L de bicarbonate de sodium, 55 mg/L de pyruvate de sodium et 4,5 g/L de glucose
gentamicine	Thermofisher Scientific	15710072	1000X le stock. Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 °C pour éviter le gel ou le dégel.
Pénicilline/streptomycine	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Référence 15140-122	Stock 100X. Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 °C pour éviter le gel ou le dégel.
Amphotéricine B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Référence 15290-018	Stock 500X. Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 °C pour éviter le gel ou le dégel.
progestérone	Sigma-Aldrich	Réf. P8783	Une solution mère de 1 mM est obtenue en reconstituant 15,7 mg de poudre de progestérone dans 15,7 mL d’éthanol et en ajoutant 34,3 mL de PBS. La solution est filtrée stérilement, aliquote et stockée à -20 °C.
17β-œstradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Une solution mère de 10 μM est obtenue en reconstituant 13,5 mg de poudre d’estradiol dans 10 mL d’éthanol et en ajoutant 40 mL de PBS. La solution est filtrée stérilement, aliquote et stockée à -20 °C.
Filtre sous vide pour bouteille (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Pour la filtration stérile des milieux de collecte après préparation
Plaque de culture tissulaire à 6 puits	BD Faucon	353224	Polystyrène, traité pour culture tissulaire
Transwells à 6 puits	Millipore	PICM03050	Insert - Membrane PTFE hydrophile de 30 mm de diamètre, taille de pores de 0,4 μm
Matrice extracellulaire (par exemple, matrice Matrigel)	BD Biosciences	354234	Nous avons utilisé la matrice Matrigel dans nos études. C’est un solide à température ambiante et à -20 °C. Évitez la congélation/décongélation répétée. Décongeler la bouteille dans une solution visqueuse à 4 °C et préparer des aliquotes de ~300 μL dans la chambre froide avec des pointes de pipette réfrigérées. Stocker les aliquotes à -20 °C.
Paraformaldéhyde, solution aqueuse à 16 % p/v	Alfa Aesar	Référence 30525-89-4	Pour la fixation des tissus, une préparation fraîche de paraformaldéhyde à 4 % est réalisée en diluant ce stock dans du PBS.
Incubateur de culture tissulaire, maintenu à 37 °C, 5 % de CO2, 3 % d’oxygène (facultatif pour les cultures d’organes villeux)			Pour certaines expériences, l’hypoxie peut être préférée. Cela peut être établi de plusieurs façons, y compris l’ajout d’azote exogène via une bouteille de gaz, un tube Tygon et un régulateur.
Centrifugeuse de paillasse