Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
ATTENTION : Travailler avec des échantillons de sang humain et des parasites du paludisme humain nécessite des mesures de précaution. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants, et travaillez dans une enceinte de biosécurité de niveau 2. En cas d’exposition percutanée accidentelle au paludisme humain, signalez-le au Service de santé et sécurité pour un traitement prophylactique. Des considérations de sécurité supplémentaires devraient également être mises en place pour travailler avec du sang du virus de l’immunodéficience humaine VIH(+). Portez une blouse de laboratoire qui se ferme dans le dos. Gant double (le gant supérieur doit être en latex). Effectuer toutes les manipulations dans une enceinte de biosécurité de niveau 2. N’utilisez pas de verre ou d’objets pointus. N’utilisez pas d’aspirateur. Placez tous les articles contaminés dans une solution de virox ou d’eau de Javel pendant au moins 1 heure avant de les jeter. Lavez toutes les surfaces avec du virox et des ultraviolets (UV) pendant 1 heure après l’utilisation. Veuillez noter que chaque établissement aura ses propres règlements spécifiques en matière de biosécurité qui doivent être respectés. Signalez toute exposition accidentelle à du sang infecté par le VIH à Santé et Sécurité aux fins d’évaluation et d’examen d’une éventuelle prophylaxie post-exposition.
Remarque : Il existe différentes souches de parasites du paludisme P. falciparum. L’ITG a été utilisé pour ces expériences, mais différentes souches peuvent être utilisées. D’excellentes instructions sur la congélation et la décongélation des parasites Plasmodium falciparum sont disponibles sur le site Web de MR4.
1. Fabrication de RPMI-A pour la culture de parasites du paludisme
- Préparez le RPMI-0 en mélangeant 950 ml d’eau doublement distillée (ddH2O), 1 sachet de poudre de Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 g d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES), 2 g de bicarbonate de sodium et 1,35 mg d’hypoxanthine.
- Décongeler le sérum humain inactivé par la chaleur de deux donneurs différents. Les donneurs AB sont les meilleurs, mais n’importe lequel peut être utilisé si les parasites sont cultivés dans des globules rouges de type O (GR). Retournez les tubes pour mélanger. Si le sérum contient des particules ou s’il est épais, essorez-le à 2 000 tr/min, puis filtrez la partie liquide à l’aide d’une unité de filtration de 0,45 μm.
- À l’aide d’une unité de filtration de 0,2 μm, filtrez 180 ml de RPMI-0, 20 ml de sérum humain (10 ml de chaque donneur) et 0,5 ml de gentamycine à 10 mg/ml.
note: Le sérum humain peut obstruer le filtre, de sorte que plus d’une unité de filtre peut être nécessaire.
- Étiquetez le flacon moyen avec le RPMI-A, la date et la source du sérum. Réfrigérer jusqu’à utilisation. Le RPMI-A peut devenir trouble lorsqu’il est réfrigéré. C’est normal, mais l’augmentation de la turbidité est un signe de contamination.
note: La croissance du parasite peut varier selon les sérums du donneur. C’est une bonne idée de tester tous les lots de sérum humain pour une bonne croissance des parasites avant de les utiliser.
2. Préparation des globules rouges humains pour la culture de parasites
Remarque : Les donneurs de sang doivent être du groupe O.
- Prélever 7 à 10 ml de sang dans des tubes d’acide-citrate-dextrose (ACD). Inscrivez le numéro d'identification du donneur et la date de prélèvement sur l'étiquette.
- Conservez le sang à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Utilisez du sang pour les cultures de parasites dans un délai de 1 mois.
- Essuyez le haut du tube avec de l’éthanol à 70 %. Retirez délicatement le bouchon et jetez-le. Transférez le sang dans un tube de 15 ml. Essorer pendant 3 min à 1 000 x g. Éliminer le plasma par aspiration.
- Suspendez les globules rouges avec un volume égal de RPMI-0 chaud. Essorez pendant 5 min à 1 000 x g. Retirez la couche leucocytaire par aspiration, remettez-la en suspension dans 5 ml de RPMI-0 et répétez le lavage 2 fois de plus.
- Retirez le surnageant et ajoutez suffisamment de RPMI-A pour produire un mélange composé à 50 % de globules rouges en volume.
- Conserver à 4 oC jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
3. Maintenir les cultures de parasites
- Préchauffer le RPMI-A à 37 °C.
- Placer les parasites décongelés (voir le protocole MR4 pour la procédure de décongélation) dans une fiole T25 avec 5 ml de RPMI-A et 75 μl de globules rouges humains lavés pour un hématocrite de ~3 %. note: L’hématocrite mesure le volume de globules rouges par rapport au volume total. Pour calculer l’hématocrite, mesurez le volume de globules rouges tassés par rapport au volume total de globules rouges moyens et supérieurs. Supposons que les parasites dégelés contribueront à hauteur de 75 μl de globules rouges. En ajoutant 150 μl de globules rouges (ce qui équivaut à ajouter 75 μl de globules rouges emballés) dans le ballon, il y a un total de 150 μl de globules rouges dans 5 ml de milieu, ce qui équivaut à un hématocrite de 3 % (150 μl/5 000 μl x 100 % = 3 %).
- Gazer le ballon pendant 30 secondes avec un mélange de gaz parasites (1 % O2, 3 % CO2, le reste N2). Scellez et placez le ballon côté large vers le bas dans un incubateur à 37 °C de manière à permettre la plus grande surface d’échange gazeux.
- Pour changer de milieu et vérifier la présence de parasitémie (cela doit être fait quotidiennement), déplacez soigneusement le ballon afin de ne pas déranger la couche de globules rouges. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile débranchée, prélevez le milieu de culture sans perturber la couche de sang.
- Pour vérifier la parasitémie, prélevez un échantillon de 10 μl de la couche de sang, placez-le sur une lame de verre et, à l’aide d’une deuxième lame de verre, créez une fine pellicule de sang. Laissez la diapositive sécher.
- Placez 4 ml de RPMI-A frais dans la fiole, mélangez délicatement, gazez pendant 30 secondes et placez dans un incubateur à 37 °C.
- Teindre la lame à l'aide du kit de coloration Hema3 selon le protocole du fabricant.
- Pour une coloration optimale, trempez les lames dans la solution de fixation pendant 10 secondes, la solution I pendant 10 secondes et la solution II pendant 30 secondes. Rincez à l’eau et laissez sécher les lames.
- Calculez la parasitémie en comptant le nombre de globules rouges de Plasmodium falciparum, les globules rouges (colorés en violet foncé) par rapport au nombre total de globules rouges (colorés en rose). Comptez un total de 300 cellules pour garantir la précision.
- Lorsque les parasites ont atteint une parasitémie de 5 %, étendre la culture dans une fiole T75, en utilisant 40 ml de RPMI-A et 500 μl de globules rouges.
4. Synchronisation parasite
Remarque : La veille de l’expérience, synchronisez la culture du parasite en la traitant avec de l’alanine. Seuls les parasites au stade annulaire et les globules rouges non infectés survivront à ce traitement. La synchronisation de l’alanine vous donnera une culture de trophozoïte pure le lendemain qui pourra être utilisée dans les expériences de co-culture. Assurez-vous de commencer avec une culture de parasites qui contient une majorité de parasites au stade annulaire.
- Préparez la solution d’alanine en mélangeant 8,01 g d’alanine (300 mM) et 0,365 g de Tris (10 mM) dans 300 ml de ddH2O. Portez le pH à 7,4. Stériliser le filtre à l’aide d’une unité de filtration de 0,2 μm.
- Préchauffer la solution d’alanine à 37 °C.
- Essorez la culture de parasites (5 min x 1 000 x g) et retirez le milieu.
- Mettre à nouveau la pastille en suspension dans 19 volumes de solution d’alanine (1 ml de globule rouge tassé pour 19 ml de solution d’alanine). Incuber pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
- Essorage 5 min x 1 000 x g. Surnageant par aspiration. Lavez une fois dans RPMI-0. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans le RPMI-A et ajuster l’hématocrite à ~3 %. Fiole à gaz et retour à 37 °C.
note: Pour les expériences de co-culture, une parasitémie minimale de 5 % de trophozoïtes est nécessaire, et 10 % de parasitémie sont considérées comme optimales.
5. Préparation des parasites et des globules rouges pour les expériences de co-culture
- Utiliser un ratio de 3 PfRBC par PBMC dans les expériences de co-culture pour induire une réponse inflammatoire. Pour calculer la PfGR totale, quantifiez la parasitémie en effectuant un mince frottis sanguin comme décrit à la section 3.5, et l’hématocrite en comptant le nombre de globules rouges par mL de culture parasitaire à l’aide d’un hémocytomètre.
Nombre de globules globulaires globulaires = % de parasitémie x globules rouges totaux/ml x ml de culture. Par exemple, 10 ml de culture à 10 x 106 GR/ml et 10 % de parasitémie sont égaux à 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
- Faites tourner la culture de parasites pendant 5 min à 1 000 x g (RT). Aspirer le milieu et remettre en suspension à raison de 6 x 106 PfRBC par ml dans du RPMI-S+ (500 ml de RPMI-1640 complété par de la L-glutamine et de l’HEPES, 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur, 1,5 ml de gentamicine, 5 ml de 100 mM de pyruvate de sodium, 5 ml de 10 mM d’acides aminés non essentiels MEM, 5 ml de 5 mM de β-mercaptoéthanol).
- Prélever du sang de contrôle (globules rouges non infectés provenant du même donneur que celui utilisé pour maintenir la culture parasitaire), calculer l’hématocrite et remettre en suspension dans RPMI-S+ au même nombre de globules rouges par ml que la culture parasitaire.
6. Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC)
- Prélever du sang veineux dans des tubes d’héparine sodique (en vert) d’un donneur VIH(+) chronique et d’un témoin VIH(-). N'utilisez pas l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant car l'action chélatrice du calcium de l'EDTA affecte la fonction cellulaire. En moyenne, attendez-vous à ce qu’il y ait entre 5 et 10 x 106 PBMC pour 10 ml de sang. Pour une expérience typique, prélevez 30 ml de sang de chaque donneur. Le volume sanguin devra être ajusté en fonction des exigences expérimentales.
- Le plus rapidement possible et certainement dans l’heure qui suit la collecte du sang, retirez le sang des tubes et placez-le dans un tube en plastique de 50 ml. Les monocytes en particulier seront activés et colleront au verre, il est donc important que si des tubes de prélèvement de sang en verre sont utilisés, les cellules soient retirées le plus rapidement possible.
- Faites tourner le sang à 1 000 x g pendant 15 minutes et prélevez du plasma (cela peut être utilisé pour d’autres études si nécessaire - sinon, cette étape peut être sautée). Diluez le sang dans un volume égal de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) froide.
- Placez 15 ml de RT Ficoll dans un tube de 50 ml. Lentement, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique stérile, superposez la solution de sang/DPBS sur le Ficoll sans aucun mélange. Un maximum de 25 ml de solution de sang/DPBS peut être superposé à chaque 15 ml de Ficoll.
- Faites tourner les pentes pendant 30 min à RT à 600 x g. Assurez-vous que le réglage « pas de frein » est activé.
- Une fois que les cellules ont tourné, cherchez l’interface entre les deux phases. C’est là que se trouvent les PBMC. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique stérile, prélevez le PBMC à partir de l’interface (voir Figure 1). Minimisez la contamination par les globules rouges.
- Placez les cellules collectées dans des tubes de 50 ml, avec un maximum de 20 ml par tube. Tube supérieur jusqu’à 50 ml avec DPBS froid stérile.
- Faites tourner les cellules pendant 10 min à 4 °C à 300 x g.
- Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 5 ml de DPBS stérile à froid et regroupez toutes les cellules du même donneur dans un seul tube. Complétez jusqu’à 50 ml avec du DPBS stérile et répétez les étapes de lavage 2 fois de plus.
- Remettre les cellules en suspension dans 10 ml de milieu RPMI-S+.
- Prélever une aliquote de 20 μl et mélanger avec 20 μl de bleu trypan. Pipetez 10 μl dans un hémocytomètre et comptez les cellules vivantes (cellules qui n’ont pas absorbé le colorant bleu – toutes les cellules bleues sont mortes). À l’aide d’un hémocytomètre, calculer le nombre de cellules dans une solution comme suit.
note: Un hémocytomètre a une grille de dimensions spécifiées afin que la zone couverte par les lignes soit connue.
- Assurez-vous que l’hémocytomètre est propre. Placez la lamelle sur la zone de comptage. Chargez 10 μl de solution cellulaire en plaçant la pointe de la pipette dans l’un des puits en forme de V. La zone sous la lamelle sera remplie par capillarité.
- Placez l’hémocytomètre chargé sous un microscope. La grille complète de l’hémocytomètre contient 9 carrés de 1 mm2 chacun. Comptez toutes les cellules à l’intérieur de chaque grand carré. S’il y a trop de cellules, diluez davantage la solution et recomptez.
- Calculez la concentration cellulaire comme suit : Nombre total de cellules/ml = (nombre total de cellules/# de carrés) x facteur de dilution x 10 000 cellules/ml, p. ex., (500 cellules/5 carrés) x facteur de dilution de 20 x 10 000 cellules/ml = 20 x 106 cellules au total.
- Ajuster le milieu à une concentration finale de 10 x 106 par ml (milieu RPMI-S+).
7. Culture de la co-infection paludisme/VIH
- Plaque de 100 μl de PBMC isolés et de 400 μl de milieu RPMI-S+ à une plaque de 24 puits (1 x 106 PBMC par puits). Assurez-vous que les puits sont configurés en trois exemplaires : 3 puits pour les globules rouges non infectés, 3 puits avec des globules rouges non infectés, 3 puits avec des globules rouges moyens, et 3 puits avec PMA/ionomycine. Cela vaut à la fois pour les échantillons VIH(+) et VIH(-).
- Pour les puits de globules globules globules métalliques, placer 3 x 106 globules rouges dans chacun des puits (500 μl de culture parasitaire préparée en 5.2).
- Dans le cas des puits de globules rouges non infectés, placer 500 μl de la culture de globules rouges non infectés préparée en 5.3 dans chacun des puits.
- Pour les puits moyens, placez 500 μl de milieu RPMI-S+ dans chacun des puits.
- Pour les puits de PMA/ionomycine, préparer une solution de PMA/ionomycine (2,5 pg/ml, 250 pg/ml respectivement). Placez 500 μl de cette solution dans chaque puits.
note: En tant que puissants stimulateurs de la sécrétion de cytokines des lymphocytes T, la PMA et l’ionomycine sont utilisées comme contrôles positifs pour assurer le fonctionnement des cellules.
- Placez la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
- Facultatif : utilisez les cellules excédentaires pour l’analyse phénotypique à l’aide de la cytométrie en flux ou stockez-les dans une solution de stabilisation de l’ARN pour une future analyse de l’expression de l’ARNm.
8. Détection des réponses immunitaires au paludisme
Remarque : Effectuez des expériences de co-culture pendant une durée pouvant aller jusqu’à 4 jours. Aucun changement de support n’est nécessaire pendant cette période. Le moment optimal dépendra du type de cellule d’intérêt et de la question posée. Une incubation de 12 à 48 heures est optimale pour les réponses monocytaires aux PfGR, tandis que les réponses lymphocytaires ont été mieux observées à 72-96 heures. Les points temporels devront être optimisés en fonction de la question expérimentale. Des périodes plus courtes (2 à 4 heures) peuvent être utilisées si l’interaction entre les globules globules rouges intacts et les PBMC est intéressante.
- Plaque de centrifugation à 300 x g pendant 3 min pour les cellules de granulés. Prélever 700 μl de surnageant de culture dans chaque puits.
- Faites tourner le surnageant à 1 000 x g pendant 5 min pour éliminer tous les débris.
- Aliquote éliminé du surnageant au besoin, étiqueter et congeler à moins de -20 °C jusqu’à ce que l’analyse des facteurs sécrétés soit effectuée.
