Induction de la maladie du greffon contre l’hôte dans des modèles murins par greffe allogénique de moelle osseuse et de cellules spléniques

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Induction GvHD

1. Jour 0 : Irradiation corporelle totale des souris receveuses
   1. Utilisez des souris femelles CD45.2+ H2kd+ BALB/c âgées d’au moins 10 semaines comme receveuses.
   2. Pesez et enregistrez le poids des souris receveuses avant l’induction de la GvHD.
      note: Assurez-vous que le receveur a un poids corporel minimal de 20 g. Le poids corporel de départ servira de valeur de référence pour calculer la perte de poids de la souris individuelle au cours de l’induction et de la progression de la GvHD.
   3. Placez jusqu’à cinq souris dans le récipient de l’irradiateur à rayons X.
   4. Irradiez les souris par irradiation corporelle totale avec une dose unique de 8 Gy de rayons X. Utilisez le Cs137 comme source de rayonnement.
2. Jour 1 : Reconstitution des souris irradiées avec une moelle osseuse appauvrie en lymphocytes T
   note: La transplantation de cellules allogéniques de moelle osseuse, telle que décrite et détaillée à la section 1.2, doit avoir lieu dans les 24 heures suivant l’irradiation. Effectuez les procédures décrites ci-dessous dans une hotte de culture de tissus stérile et utilisez des réactifs filtrés. Utilisez des allogènes CD45.1/Ly5.1 B6. Souris SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl comme donneuses de moelle osseuse appauvrie en lymphocytes T.
   1. Euthanasier CD45.1/Ly5.1 B6. Souris SJL qui donneront des cellules allogéniques de moelle osseuse conformément aux directives de l’établissement, 12 à 24 h après l’irradiation des souris BALB/c receveuses. Pour cela, anesthésez le CD45.1/Ly5.1 B6. Souris SJL par inhalation d’isoflurane à 5 %. Poursuivre l’exposition à l’isoflurane plus de 1 minute après l’arrêt respiratoire et confirmer l’euthanasie par luxation cervicale.
   2. Désinfectez soigneusement la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
   3. Placez la souris sur une gaine propre de manière à ce qu’elle soit en position couchée, avec son arrière-train face à l’expérimentateur. Soulevez la fourrure au talon d'Achille avec la pointe d'une pince Semken d'une longueur de 13 cm et des pointes incurvées dentelées. Incisez la peau entre la pince et le talon avec des ciseaux fins durcis de 8,5 cm à pointes droites.
   4. Allongez l’incision crânienne (c’est-à-dire du talon sur le bas de la jambe et la cuisse jusqu’à la région de la hanche). Retirez la peau et la fourrure du membre postérieur à l’aide de la pince.
   5. Effectuez la même procédure sur l’autre membre postérieur.
   6. Retirez les membres postérieurs en coupant les articulations adjacentes de la hanche.
   7. Coupez les pattes arrière. Coupez à travers l’articulation du genou. Rangez la cuisse et le jarret de chaque membre postérieur ensemble dans une boîte de Pétri de 92 mm remplie d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur de la glace.
   8. Nettoyez soigneusement les os du fémur et du tibia en retirant autant de tissu musculaire que possible de chaque cuisse et tige. Transférez les os du fémur et du tibia dans un tube de 50 mL rempli de milieu stérile RPMI 1640 et placez-le sur de la glace humide jusqu’à ce que tous les os du tibia et du fémur prélevés à l’étape 1.2.7 soient nettoyés du tissu musculaire.
   9. Pour isoler la moelle osseuse, transférez un fémur ou un os du tibia à la fois (qui a été nettoyé comme décrit à l’étape 1.2.8) du tube de 50 mL dans une boîte de Pétri (d’un diamètre de 92 mm) remplie de milieu RPMI 1640. Coupez les extrémités du fémur ou du tibia à l’aide d’un scalpel pour accéder à la cavité de l’os contenant la moelle osseuse.
   10. Préparez un tube de prélèvement de 50 ml avec 5 ml de milieu RPMI 1640. Insérez une aiguille de 26 G attachée à une seringue de 1 mL remplie de 1 mL de milieu RPMI 1640 dans la cavité osseuse et rincez la moelle osseuse de la cavité dans le tube de prélèvement en poussant le piston.
   11. Répétez l’étape 1.2.10 jusqu’à ce que l’os apparaisse clair et brillant (c.-à-d. que la cavité osseuse est visiblement dépourvue de moelle osseuse rougeâtre). Jetez l’os vide.
   12. Répéter les étapes 1.2.9 à 1.2.11, en utilisant tous les os du fémur et du tibia de l’étape 1.2.8, et prélever tous les morceaux de moelle osseuse récupérés dans le même tube de prélèvement de 50 ml que celui de l’étape 1.2.10. Conservez le tube de prélèvement sur de la glace humide jusqu’à ce que tous les os de l’étape 1.2.8 aient été traités en conséquence.
   13. Créez une suspension unicellulaire en pipetant doucement les morceaux de moelle osseuse rincés et friables de haut en bas. Filtrer la suspension unicellulaire de moelle osseuse à l’aide d’une crépine à mailles de 40 μm placée sur un nouveau tube de prélèvement de 50 mL.
   14. Centrifuger le tube de prélèvement de 50 mL contenant la suspension unicellulaire de moelle osseuse à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
   15. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de tampon de lyse ACK (1 mM Na²EDTA ; 10 mM KHCO₃ ; 144 mM NH₄Cl ; pH 7,2) pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez immédiatement 10 ml de solution de PBS à la suspension cellulaire.
   16. Centrifuger la suspension à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution de PBS.
   17. Compter les cellules de la moelle osseuse à l’aide d’un hémocytomètre. Conservez une aliquote de 6 x 10⁶ cellules pour l’analyse par cytométrie en flux afin de vérifier la pureté des cellules après purification des cellules (voir étape 1.2.20).
   18. Pour l’épuisement des lymphocytes T de la suspension unicellulaire de la moelle osseuse, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce. Appauvrir magnétiquement les cellules CD90.2+ (c.-à-d. les lymphocytes) des cellules totales de la moelle osseuse, conformément au protocole du fabricant.
   19. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules de moelle osseuse appauvries en lymphocytes T qui ont été isolées comme décrit à l’étape 1.2.18. Conserver une aliquote de 1 x 106 cellules pour l’analyse par cytométrie en flux qui sera effectuée ultérieurement, comme décrit à l’étape 1.2.20.
       note: Le rendement cellulaire moyen dérivé d’une souris donneuse est généralement de 2 x 107 à 3,4 x 107 cellules de moelle osseuse appauvries en lymphocytes T.
   20. Confirmer une déplétion réussie des lymphocytes T par cytométrie en flux. Coloration 1 x 10⁶ cellules, préservées à partir des étapes 1.2.17 (cellules de la moelle osseuse avant séparation magnétique des cellules) et 1.2.19 (cellules de la moelle osseuse appauvries en cellules T après séparation magnétique des cellules), avec les anticorps suivants : α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) et α-CD8α (53-6.7). Utilisez les cellules restantes de l’étape 1.2.17 comme témoin non coloré et, pour les témoins monocoloration, pour configurer le cytomètre en flux.
       1. Transférez 1 x 10⁶ cellules de chaque échantillon dans un puits d’une plaque de 96 puits avec un fond en V pour effectuer la procédure de coloration par cytométrie en flux.
       2. Faire tourner les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits (étape 1.2.20.1) à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS (PBS complété par du sérum de bovin filtré à 3 %).
       3. Centrifuger les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
       4. Ajouter une quantité appropriée de l’anticorps de votre choix (comparer avec l’étape 1.2.20) aux échantillons pour une coloration unique dans 100 μL de tampon FACS.
       5. Préparez un mélange de tous les anticorps (mélange maître) contenant les quantités appropriées suffisantes pour colorer séparément les aliquotes des cellules de la moelle osseuse conservées après la déplétion magnétique des lymphocytes T avant (voir étape 1.2.17) et après (voir étape 1.2.19). Ajouter 100 μL du mélange principal aux deux aliquotes.
       6. Ajoutez seulement 100 μL de tampon FACS à l’échantillon non coloré.
       7. Incuber les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité.
       8. Ajouter 100 μL de tampon FACS et centrifuger les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
       9. Centrifuger les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 250 μL de tampon FACS.
       10. Transvasez les échantillons dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 mL et analysez-les à l’aide d’un cytomètre en flux capable de détecter les molécules fluorescentes qui ont été utilisées pour marquer les anticorps utilisés pour caractériser les échantillons de cellules (voir l’étape 1.2.20).
       11. Comparez la composition des cellules avant et après la séparation magnétique des cellules.
           note: Une pureté d’environ 95 % de cellules CD45.1+CD3- (c’est-à-dire de moelle osseuse appauvrie en lymphocytes T) à l’intérieur de la porte vivante est généralement atteinte.
   21. Lavez les suspensions de cellules de moelle osseuse appauvries en cellules T 2 fois avec une solution de PBS (450 x g pendant 5 min à 4 °C) et, enfin, remettez en suspension les cellules dans une solution de PBS, en ajustant la concentration cellulaire à 5 x 10⁷ cellules/mL. Conservez les cellules sur de la glace humide jusqu’à l’injection.
   22. Injectez des cellules de moelle osseuse appauvries en lymphocytes T dans les souris receveuses, qui ont été irradiées la veille (voir rubrique 1.1).
       1. Placez la souris expérimentale dans une chambre étanche et induisez une anesthésie par inhalation d’un maximum de 4 % d’isoflurane, jusqu’à ce que la souris soit inconsciente. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente du réflexe de retrait de la pédale.
       2. Injecter 5 x 10^{cellules de moelle} osseuse appauvries en 6 lymphocytes T (c.-à-d. 100 μL de 5 x 10⁷ cellules/mL) contenant une solution de PBS à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 30 G par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbaire contenant le sinus veineux.
3. Jour 2 : Transfert des lymphocytes T
   note: Effectuez les procédures décrites ci-dessous dans une hotte de culture de tissus stérile et utilisez des réactifs filtrés. Utilisez CD45.2 C57Bl/6 (type sauvage ; WT) comme donneurs de lymphocytes T alloréactifs. L’utilisation de systèmes de marqueurs congéniques permet de distinguer les types de cellules hématopoïétiques du receveur (souris CD45.2+ H2kd+ Balb/c) et du donneur (cellules de la moelle osseuse : CD45.1+ H2kb+ B6. souris SJL ; lymphocytes T allogéniques : souris CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6).
   1. Euthanasier les souris C57Bl/6 conformément aux directives et aux autorités de l’établissement en vigueur. Par conséquent, anesthésez les souris par inhalation avec une concentration de 5 % d’isoflurane. Poursuivre l’exposition à l’isoflurane jusqu’à 1 minute après l’arrêt respiratoire et confirmer l’euthanasie par luxation cervicale. Désinfectez soigneusement la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Placez une passoire avec un tamis à mailles de 40 μm sur un tube de collecte de 50 mL. Retirez la rate et placez-la sur la passoire.
   3. À l’aide d’un piston de seringue, humidifiez la rate dans la passoire. Lavez la passoire et le piston de la seringue avec du PBS pour recueillir tous les splénocytes.
   4. Centrifuger les cellules à l’intérieur du tube de prélèvement de 50 mL à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
   5. Remettre les splénocytes en suspension dans 3 mL de tampon de lyse ACK pour lyser les globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min. Ensuite, ajoutez 10 ml de PBS et centrifugez les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et remettez en suspension les splénocytes dans le PBS.
   6. Comptez les cellules de la rate à l’aide d’un hémocytomètre. Détourner une aliquote de 6 x 10⁶ cellules pour l’analyse par cytométrie en flux, afin d’évaluer l’ampleur de la purification à l’étape 1.3.9.
   7. Pour isoler les lymphocytes T CD3+ totaux des splénocytes, utilisez une trousse de purification cellulaire disponible dans le commerce. Isolez les lymphocytes T spléniques, en suivant le protocole du fabricant.
   8. Compter les lymphocytes T CD3+ spléniques isolés comme décrit à l’étape 1.3.7, à l’aide d’un hémocytomètre. Conserver une aliquote de 1 x 10^{cellules T 6} pour l’analyse par cytométrie en flux.
      note: Le rendement moyen en lymphocytes T spléniques par souris donneuse isolée par séparation magnétique cellulaire varie de 1,3 x 10⁷ à 2 x 10⁷ cellules.
   9. Confirmer le succès de l’isolement des lymphocytes T par cytométrie en flux. Pour une description détaillée du protocole de coloration, consultez et suivez les étapes 1.2.20.1 à 1.2.20.10.
      1. Colorer 1 x 10⁶ splénocytes des étapes 1.3.6 (avant la séparation des cellules magnétiques) et 1.3.8 (après la séparation des cellules magnétiques) avec les anticorps suivants : α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) et α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilisez les cellules restantes de l’étape 1.3.6 comme contrôle non coloré et pour la coloration unique avec les anticorps respectifs, afin de configurer le cytomètre en flux.
      3. Comparez la composition des cellules avant et après la séparation magnétique des cellules.
         note: Une pureté de ≥95 % des lymphocytes T CD45.2+CD3+ à l’intérieur de la porte active des lymphocytes devrait être atteinte.
   10. Lavez les cellules T 2 fois avec du PBS (450 x g pendant 5 min à 4 °C) et, enfin, remettez les cellules en suspension dans une solution de PBS, en ajustant la concentration cellulaire à 7 x 10⁶ cellules/mL. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’à l’injection.
   11. Injecter des lymphocytes T spléniques alloréactifs (voir l’étape 1.3.10) à des souris BALB/c irradiées qui ont déjà reçu des cellules de moelle osseuse appauvries en cellules T CD45.1+ (voir l’étape 1.2.22).
       1. Induisez une anesthésie en plaçant la souris expérimentale dans une chambre étanche dans laquelle elle est exposée à un maximum de 4 % d’isoflurane jusqu’à ce qu’elle perde connaissance. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente du réflexe de retrait de la pédale.
       2. Injecter 0,7 x 10⁶ lymphocytes T CD3+ alloréactifs à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 30 G (c.-à-d. 100 μL de 7 x 10⁶ cellules/mL) contenant une solution de PBS (voir l’étape 1.3.10), par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbaire des souris, afin d’induire la GvHD. Désignez ces souris comme le groupe expérimental.
       3. Injecter à un autre groupe de souris 100 μL de PBS seul, par voie intraveineuse, dans l’espace rétrobulbaire, et désigner ce groupe comme le groupe témoin, appelé par la suite « souris sans greffe de cellules T (noT) ».