1. Purification in vitro de sporozoïtes à partir d’oocystes de C. parvum
- Purifier les sporozoïtes des oocystes de C. parvum après le blanchiment et le lavage de l’eau de Javel comme décrit ci-dessus.
- Transférez les oocystes dans un tube de 15 ml. Remettre les oocystes en suspension dans un milieu d’excystation à température ambiante (0,75 % p/v de taurocholate de sodium dans le DMEM) pour obtenir 1 x 107 oocystes/mL. L’ajout de taurocholate améliore le taux d’excystation des oocystes, améliorant ainsi le rendement en sporozoïtes.
- Incuber la suspension d’oocystes à 37 °C pendant 1 à 1,5 h.
- Vérifiez l’échantillon au microscope pour déterminer l’étendue de l’excystation ; une excystation de 60 à 80 % est raisonnable pour une bonne récupération des sporozoïtes. Si le niveau d’excystation est faible, incuber plus longtemps (encore 30 min à 1 h).
- Déterminez le pourcentage d’excystation par rapport au nombre d’oocystes débutants. L’excystation est calculée comme suit :
% d’excystation = [1 – (nombre d’oocystes intacts/nombre d’oocystes au départ)] x 100
- Laver les cellules pour éliminer les réactifs d’excystation en ajoutant 14 mL de PBS ou de milieu, en mélangeant et en récupérant les cellules (oocystes intacts, coquilles d’oocystes et sporozoïtes) par centrifugation à 3 400 x g pendant 20 minutes pour récupérer les sporozoïtes. Aspirez soigneusement pour éviter de perdre des cellules.
- Remettre en suspension la pastille de sporozoïte dans 1 à 2 mL de DMEM pour obtenir 3 x 107 oocystes/mL (en fonction du nombre d’oocystes de départ).
- Pour éliminer les oocystes et les coquilles restants, filtrez la suspension à l’aide d’un filtre de 3 μm (figure 1B). Utilisez un porte-filtre de 47 mm équipé d’un filtre en polycarbonate (pores de 3 μm) fixé à un cylindre de seringue de 10 ml. Placez l’appareil du porte-filtre sur un tube de 15 ml. Placez l’ensemble dans un seau à glace ou dans une chambre froide.
- Ajoutez 7,5 ml de suspension de sporozoïte à l’ensemble de filtre et laissez-le filtrer par gravité. Laver avec 7,5 mL de DMEM.
note: Pour assurer le succès de l’isolement des sporozoïtes, des oocystes frais et une bonne excystation sont essentiels. S’il y a trop d’oocystes non exkystés, la suspension ne s’écoulera pas par gravité. L’application d’une pression sur la seringue peut forcer les oocystes non exkystés à travers. La micro-injection de sporozoïtes est plus difficile que celle d’oocystes, car les sporozoïtes peuvent s’agglutiner et bloquer le capillaire. Pour éviter cela, nous vous recommandons de faire un embout capillaire plus large lors de l’injection d’organoïdes avec des sporozoïtes. Pour atteindre des niveaux d’infection suffisants, il faut injecter 2 à 4 fois plus de sporozoïtes dans chaque organoïde que dans les organoïdes infectés par des oocystes.
- Centrifuger la suspension de sporozoïtes filtrés à 3 400 x g à l’aide d’un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes pour granuler les sporozoïtes.
- Remettre en suspension dans 50 à 100 μL de milieu de culture organoïde OME ou OMD (voir le tableau des matériaux) complété par un colorant vert rapide à 0,05 % (p/v) et du L-glutathion, de la bétaïne, de la L-cystéine, de l’acide linoléique et un tampon réducteur contenant de la taurine (voir le tableau des matériaux).
note: L’incubation prolongée des oocystes peut entraîner la lyse des sporozoïtes et une mauvaise récupération et doit donc être évitée.
2. Culture in vitro de l’intestin humain pour micro-injection
- Culture d’organoïdes intestinaux dans des conditions de milieu d’expansion et de différenciation.
REMARQUE : Les détails de la propagation intestinale ont déjà été décrits dans d’autres articles (voir la Table des matériaux pour les recettes de milieux). Ici, nous décrivons brièvement la méthode de culture d’organoïdes avec une référence spécifique à l’optimisation pour l’injection et la croissance de Cryptosporidium. Nous avons constaté que pour l’imagerie des parasites dans les organoïdes, les organoïdes cultivés dans un milieu d’expansion sont préférables à ceux cultivés dans un milieu de différenciation car il y a moins d’accumulation de débris que ceux observés dans les organoïdes cultivés dans un milieu de différenciation. Cependant, si l’objectif est d’isoler les oocystes, les organoïdes cultivés dans des milieux de différenciation produisent un nombre beaucoup plus élevé d’oocystes.
- Maintenir les organoïdes dans les cultures 3D dans la matrice extracellulaire (voir le tableau des matériaux) à 37 °C. Ajouter des OME (milieux d’expansion organoïdes) sur le dessus et rafraîchir tous les jours.
- Pour diviser et mettre en plaque des organoïdes pour la microinjection, retirez le milieu de la plaque à 6 puits contenant des organoïdes humains, ajoutez du F12+++ (voir la table des matériaux) dans le puits et brisez la matrice en pipetant plusieurs fois avec une pointe de pipette de 1 ml. Prélever les cellules dans un tube de 15 mL (2 mL de F12+++ par tube suffisent pour d’autres procédures).
- Ajoutez 10 à 12 ml de F12+++ dans un autre tube de 15 ml et placez une pipette en verre poli au feu dans le milieu, pipetez de haut en bas 3 fois pour briser les organoïdes intestinaux humains.
note: Utilisez une longue pipette en verre (20 à 30 cm) et polissez-la brièvement au feu. Ne faites pas l’ouverture (1 mm de diamètre) très petite car les organoïdes peuvent être endommagés. Rendez la pointe de la pipette lisse en la polissant brièvement au feu. Casser les organoïdes en petits morceaux de ~50 μm.
- Ajouter F12+++ jusqu’à 5–7 mL et centrifuger à 350 x g pendant 5 min.
note: La vitesse de centrifugation dans cette étape est plus élevée que la normale afin de fabriquer une bonne pastille cellulaire bien séparée de la matrice extracellulaire (voir Tableau des matériaux). Nous avons observé que, par rapport aux organoïdes de l’intestin grêle de souris, les organoïdes de l’intestin grêle humains sont plus difficiles à perturber.
- Retirer autant de milieu que possible sans déranger les cellules, puis remettre en suspension la pastille avec une matrice maintenue à 4 °C ; 200 à 300 μL de matrice par puits d’une plaque à six puits sont nécessaires. Les organoïdes doivent être divisés un en trois pour maintenir une densité cellulaire assez élevée.
- Plaquez les organoïdes en gouttelettes matricielles d’environ 5 à 10 μL chacune dans le puits d’une plaque à six puits. Incuber pendant 20 à 30 min à 37 °C, puis ajouter un milieu d’expansion (OME) sur le dessus.
- Changez de milieu tous les 2 à 3 jours.
note: En 5 à 7 jours environ, les organoïdes qui poussent dans l’EM atteignent une taille de 100 à 200 μm et sont prêts à être injectés.
- Pour différencier les organoïdes, après 5 à 6 jours dans l’EM, changez le milieu dans les conditions de milieu de différenciation (DM) et conservez-le pendant 5 à 6 jours supplémentaires avant d’injecter les parasites.
note: Pour l’expansion des organoïdes, il est recommandé de plaquer les organoïdes densément. Pour la microinjection, l’utilisation d’une plaque à six puits est recommandée avec des organoïdes plaqués à une densité moindre. Par exemple, plaquez les organoïdes de trois puits d’une plaque à six puits dans une plaque complète à six puits pour les micro-injections. La matrice doit être maintenue à -20 °C pour un stockage à long terme et décongelée à 4 °C ou sur de la glace avant utilisation.
3. Micro-injection d’oocystes/sporozoïtes dans la lumière organoïde
- Microinjectez des parasites dans la face apicale de l’organoïde 3D (Figure 2).
- Préparez des capillaires en verre de 1 mm de diamètre à l’aide d’un extracteur de micropipettes.
note: Les paramètres utilisés sur l’extracteur de micropipettes (voir le tableau des matériaux) sont Chaleur = 663, Traction = 100, Vitesse = 200, Temps = 40 ms. Les paramètres devront être ajustés en fonction des instructions d’utilisation d’une machine particulière.
- Coupez l’extrémité du capillaire à l’aide d’une pince. La taille/le diamètre de l’extrémité capillaire mesure environ 9 à 12 μm ; Cela permet un écoulement facile des oocystes (taille 4 à 5 μm).
- Remplissez les capillaires avec une suspension d’oocyste ou de sporozoïte à l’aide d’embouts de microchargeur.
- Chargez le capillaire rempli d’oocystes dans un micro-injecteur.
- Microinjectez une suspension de 100 à 200 nL dans chaque organoïde sous un microscope inversé à un grossissement de 5x, en maintenant la pression constante. Après la microinjection, rafraîchir le milieu avec de l’OME ou de l’OMD (milieu de différenciation organoïde) tous les jours et maintenir la plaque à 37 °C.
note: Nous n’utilisons pas de micromanipulateur pour la microinjection. L’utilisation du même capillaire est recommandée pour l’ensemble de l’expérience afin d’assurer une injection égale dans chaque échantillon.
