Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Infection
- Infectez les moustiques Anopheles stephensi avec Plasmodium berghei ANKA en les nourrissant pendant 15 min sur une souris gamétocytémique. Maintenez les moustiques infectés à 80 % d’humidité et à 21 °C.
- Prélever les moustiques femelles dans leur cage 17 à 22 jours après le repas de sang. Placez-les sur de la glace pour les anesthésier.
- À l’aide d’une pince, placez trois à quatre moustiques sur une lame de verre recouverte d’une goutte de milieu RPMI froid. Placez la lame sous un microscope.
- À l’aide d’une pince, étirez soigneusement le moustique entre la tête et le corps. Isolez la glande salivaire à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Répétez cette procédure avec les moustiques restants.
- Prélevez les glandes salivaires de la lame de verre en les aspirant à l’aide d’une pipette en verre et en les recueillant dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
note: Selon les taux d’infection, 8 000 à 15 000 sporozoïtes infectieux peuvent être obtenus par glande salivaire.
- Pendant environ 3 minutes, écrasez les glandes salivaires isolées à l’intérieur du tube de centrifugation avec un petit bâtonnet en plastique pour isoler les sporozoïtes du tissu des glandes salivaires.
- Centrifuger pendant 3 min à 1 000 x g et 4 °C pour purifier les sporozoïtes des tissus restants.
- Pipetez le surnageant, qui contient les sporozoïtes (SPZ), dans un nouveau tube à centrifuger et comptez les sporozoïtes purifiés dans un hémocytomètre Neubauer.
- Ajuster la concentration de sporozoïtes purifiés à 10 000/mL en ajoutant une solution saline tamponnée au phosphate.
- Injecter un total de 1 000 sporozoïtes (0,1 ml) dans les veines de la queue de souris consanguines C57BL/6 pour initier l’infection. Pour faciliter les injections, placez les souris C57BL/6 dans une unité de contention et placez les queues dans de l’eau chaude (environ 37 °C) pour faciliter la visualisation des veines de la queue.
note: L’injection elle-même est une procédure courte qui peut être effectuée en quelques secondes.
- Une fois par jour, vérifiez la parasitémie au stade sanguin sur les frottis sanguins à partir du 3e jour après l’infection SPZ.
- Évaluez les souris une fois par jour avec le score RMCBS (Rapid Murine Coma and Behavior Scale), à partir du jour 5 après l’injection de sporozoïte.
- Évaluez les souris à l’aide d’une imagerie par résonance magnétique (IRM) en fonction du score de l’échelle RMCBS (Rapid Murine Coma and Behavior Scale) et de la question de recherche à aborder.
