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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Macrophages de lavage broncho-alvéolaire (BAL)
- Utilisez BAL pour obtenir des macrophages pulmonaires chez (1) des sujets humains par bronchoscopie, et (2) des souris en utilisant l’aspiration intra-trachéale.
note: L’acquisition des macrophages provoque généralement une certaine activation de ces cellules. Les macrophages sont obtenus chez des patients qui nécessitent une bronchoscopie pour étudier un problème médical potentiel et tous les sujets peuvent ne pas convenir à l’analyse des pièges extracellulaires des macrophages, ou MET (cela devra être déterminé pour chaque projet individuel).
- Prenez la solution BAL et essorez-la (500 x g pendant 10 min) pour former une pastille, lavez-la deux fois avec un milieu de culture (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) avec 5 % de sérum de veau fœtal et 1 % de L-glutamine) à température ambiante, puis diluez les cellules dans 4 ml de milieu de culture.
- Si nécessaire, demandez une numération différentielle formelle ; la plupart des cellules (généralement >80 %) seront des macrophages.
note: Celle-ci sera généralement réalisée par un service d’histologie clinique à partir de l’aspect morphologique des différents types de cellules.
- Effectuer une numération viable des cellules macrophages sur la solution BAL à l’aide de l’exclusion du bleu de trypan et d’un hémocytomètre.
note: La solution de BAL est obtenue à partir d’humains et de souris comme mentionné à l’étape 1.1.
- Ajouter 1 à 4 x 105 macrophages dans des plaques de 24 puits sur des lamelles de recouvrement dans 500 μL de milieu de culture par puits et laisser reposer toute la nuit à 37 °C ; les cellules adhéreront aux lamelles. Pour les échantillons humains, ajoutez des antibiotiques (p. ex. pénicilline et streptomycine, 10 à4 U/mL) pour prévenir la contamination bactérienne.
2. Marquage par immunofluorescence/microscopie des macrophages BAL
REMARQUE : Les cellules sont collées sur des lamelles comme mentionné ci-dessus.
- Retirez le milieu de culture et lavez une fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Fixer les cellules dans un fixateur de paraformaldéhyde/periodate/lysine (PLP) à 2 % pendant 10 min.
- Laver brièvement les cellules dans du PBS, puis les perméabiliser dans 0,2 % de Tween 20 dans du PBS pendant 20 min.
- Cellules en bloc avec 10 % de sérum de poulet dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % diluée dans du PBS pendant 30 min.
- Incuber avec des anticorps de contrôle primaires et isotypiques pendant 1 h à température ambiante à des concentrations de 1:100 (des détails plus spécifiques sont énumérés dans le tableau des matériaux) à 37 °C
note: Pour les échantillons BAL, un marqueur spécifique de macrophages n’est généralement pas nécessaire.
- Après l’ajout d’anticorps primaires, lavez les cellules dans du PBS et incubez davantage avec les anticorps secondaires correspondants pendant 40 minutes à température ambiante.
- Lavez les sections dans du PBS et montez-les avec un support de montage basé sur DAPI pour la visualisation à l’aide d’un microscope confocal (comme mentionné ci-dessus) à des excitations laser de 405, 488, 561 et 647 nm et d’un objectif à huile 40X, 1,0 NA.