1. Inoculation par pulvérisation avec une suspension de conidies de M. grisea
- Culture fongique de M. grisea
- Préparez le milieu de culture de gélose tomate avoine (OTA) pour les souches fongiques.
- Pesez 30 à 50 g de flocons d’avoine, ajoutez-les à 800 ml d’eau distillée/déminéralisée (jjH2O) et faites bouillir le mélange pendant 30 minutes dans la casserole électrique.
- Filtrez le jus d’avoine bouilli dans le bécher à travers un morceau de gaze.
- Ajouter 150 mL de jus de tomate et 20 g de gélose au filtrat dans le bécher et ajouter du ddH2O jusqu’à 1 000 mL.
- Préparation du matériel expérimental
- Faites tremper environ 50 graines de riz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) dans jdH2O pendant 3 j ou trempez environ 50 graines d’orge (Hordeum vulgare cv Golden Promise) dans jdH2O pendant environ 1 j.
- Enveloppez les graines de riz ou d’orge dans de la gaze humide et faites-les germer sur du papier filtre humide dans environ 30 boîtes de Pétri d’un diamètre de 10 cm x 10 cm à 28 °C. Le temps de germination des graines de riz est d’environ 2 à 3 jours et le temps de germination des graines d’orge est d’environ 2 jours. L’humidité relative dans la serre est d’environ 70 %.
- Plantez les plants de riz ou d’orge en pot à l’aide de terreau autoclavé et d’un arrosage puis recouvrez-les d’une couche de vermiculite.
- Placez les plantes dans une serre ou une armoire de culture appropriée à 25 °C pendant environ 1 ~ 2 semaines.
- Découpez 3 couches de papier filtre en cercles avec des ciseaux chirurgicaux stériles (chaque cercle doit avoir un diamètre de 8 cm) et placez-les sur des plaques en plastique stérile de 100 mm.
- Ajoutez du jdH2O dans chaque plat pour imbiber le papier filtre.
- Assurez-vous que le papier filtre est complètement humide, mais n’ajoutez pas d’eau supplémentaire.
- Éliminez tout excès d’eau à l’aide d’une pompe à vide.
- Placez 2 cure-dents stériles dans le plat de culture pour soutenir les feuilles de riz/orge ; espacez les cure-dents de ~2 à 3 cm.
- Récoltez les feuilles du riz 2 semaines après le semis des graines ou prélevez les feuilles de l’orge 7 jours après le semis des graines.
- À l’aide de semis de riz/orge de 4 à 6 feuilles, coupez la partie inférieure de la tige à ~5 cm du haut et récupérez les feuilles.
- Protocole d’inoculation par pulvérisation
- Cultivez la souche fongique sur des plaques OTA dans un incubateur thermostatique (25 °C) pendant ~4 jours.
- Ajouter ~2 mL de ddH2O à l’aide d’une pipette de 0,5 à 5 mL dans chaque plaque de 4 jours.
- À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez le mycélium de la souche sauvage de M. grisea et la souche mutante pour en faire des débris de mycélium.
- Récupérez les débris de mycélium et transférez-les sur une nouvelle plaque OTA. Prenez les débris de mycélium et séchez-les au sèche-cheveux sur le banc propre.
- Recouvrez la plaque de 3 couches de gaze pour assurer l’humidité nécessaire à la croissance des conidies dans une serre à 25 °C le jour (14 h) et à 23 °C la nuit (10 h) pendant 24 à 48 h.
- Ajoutez 2 mL de ddH2 Odans chaque plat et grattez doucement les conidies avec des cotons-tiges stériles suivis d’une filtration à travers 2 couches de papier lentille. Veillez à ne pas rayer la surface du milieu de culture.
- Transférez la suspension de conidies dans un nouveau tube de 50 ml à l’aide d’une pipette de 100 à 1 000 μl.
- Centrifuger pendant 5 min à un minimum de 5 000 x g à 25 °C.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension pour obtenir 2 x 104 conidies par mL dans une solution de Tween-20 à 0,025 % (v/v). La solution Tween-20 est généralement d’environ 10 à 20 ml.
- Versez la suspension de spores dans un pulvérisateur à main.
- Verser environ 10 mL de la suspension conidique sur les feuilles de riz des semis de riz âgés de 2 semaines ou les feuilles d’orge des plants d’orge âgés de 7 jours et les incuber à 25 °C dans une chambre sombre et humide pendant ~24 h. Pulvériser les plantes témoins avec la solution Tween-20 à 0,025 % (v/v).
- Transférez les feuilles dans une autre chambre humide sous une lumière fluorescente à 25 °C pendant une photopériode de 12 h.
- Noter les symptômes de la maladie 5 jours après l’inoculation. Examinez les brins de riz/orge malades de ~6 cm de longueur. La norme d’évaluation est conforme au système de notation de la résistance à la souffle de l’Institut international de recherche sur le riz (IRRI). Le tableau 1 présente les détails du système de pointage pour la résistance aux explosions.
- Photographiez les feuilles pour évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6cm2.
Tableau 1 : Un système de notation pour la résistance aux explosions. Le tableau est cité par l’Institut international de recherche sur le riz (IRRI).
| écaille | description |
| 1 | Petites taches brunes de la taille d’un point précis |
| deux | Petites taches grises nécrotiques arrondies à légèrement allongées, d’environ 1 à 2 mm de diamètre, avec une marge brune distincte. Les lésions se trouvent principalement sur les feuilles supérieures |
| 3 | Le type de lésion est le même que chez les feuilles 2, mais un nombre important de lésions se trouvent sur les feuilles supérieures |
| 4 | Lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectant moins de 4 % de la surface foliaire |
| 5 | Lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectant moins de 4 à 10 % de la surface foliaire |
| 6 | Lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectant moins de 11 à 25 % de la surface foliaire |
| 7 | Lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectant moins de 26 à 50 % de la surface foliaire |
| 8 | Lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectant moins de 51 à 75 % de la surface foliaire, de nombreuses feuilles mortes |
| 9 | Les lésions pyriculaires sensibles typiques, de 3 mm ou plus, infectent plus de 75 % de la surface foliaire |
