1. Culture fongique de M. grisea
- Préparez le milieu de culture de gélose tomate avoine (OTA) pour les souches fongiques.
- Pesez 30 à 50 g de flocons d’avoine, ajoutez-les à 800 ml d’eau distillée/déminéralisée (jjH2O) et faites bouillir le mélange pendant 30 minutes dans la casserole électrique.
- Filtrez le jus d’avoine bouilli dans le bécher à travers un morceau de gaze.
- Ajouter 150 mL de jus de tomate et 20 g de gélose au filtrat dans le bécher et ajouter du ddH2O jusqu’à 1 000 mL.
2. Préparation du matériel expérimental
- Faites tremper environ 50 graines de riz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) dans jdH2O pendant 3 j ou trempez environ 50 graines d’orge (Hordeum vulgare cv Golden Promise) dans jdH2O pendant environ 1 j.
- Enveloppez les graines de riz ou d’orge dans de la gaze humide et faites-les germer sur du papier filtre humide dans environ 30 boîtes de Pétri d’un diamètre de 10 cm x 10 cm à 28 °C. Le temps de germination des graines de riz est d’environ 2 à 3 jours et le temps de germination des graines d’orge est d’environ 2 jours. L’humidité relative dans la serre est d’environ 70 %.
- Plantez les plants de riz ou d’orge en pot à l’aide de terreau autoclavé et d’un arrosage puis recouvrez-les d’une couche de vermiculite.
- Placez les plantes dans une serre ou une armoire de culture appropriée à 25 °C pendant environ 1 ~ 2 semaines.
- Découpez 3 couches de papier filtre en cercles avec des ciseaux chirurgicaux stériles (chaque cercle doit avoir un diamètre de 8 cm) et placez-les sur des plaques en plastique stérile de 100 mm.
- Ajoutez du jdH2O dans chaque plat pour imbiber le papier filtre.
- Assurez-vous que le papier filtre est complètement humide, mais n’ajoutez pas d’eau supplémentaire.
- Éliminez tout excès d’eau à l’aide d’une pompe à vide.
- Placez 2 cure-dents stériles dans le plat de culture pour soutenir les feuilles de riz/orge ; espacez les cure-dents de ~2 à 3 cm.
- Récoltez les feuilles du riz 2 semaines après le semis des graines ou prélevez les feuilles de l’orge 7 jours après le semis des graines.
- À l’aide de semis de riz/orge de 4 à 6 feuilles, coupez la partie inférieure de la tige à ~5 cm du haut et récupérez les feuilles.
3. Inoculation de plaie avec des cubes de mycélium ou des gouttelettes de suspension conidique de M. grisea
- À l’aide d’une aiguille anatomique, grattez trois plaies de 2 à 3 cm de long dans les nervures principales des feuilles de riz/orge détachées ; en prenant soin de ne pas pénétrer dans les feuilles.
- Placez les feuilles grattées sur des cure-dents et vaporisez une solution Tween-20 à 0,02 % (v/v) sur les feuilles pour former une couche de gouttelettes.
- Coupez un bouchon mycélien de 0,5 cm x 0,5 cm pour chaque souche de M. grisea (de type sauvage, mutant, souches de complément ou autres souches d’essai) à partir d’une plaque OTA.
- Placez les bouchons mycéliens ou les gouttelettes de 25 μL de suspension conidique sur les feuilles blessées et incubez les feuilles à 25 °C dans une chambre humide pendant 3 à 8 jours.
- Examiner les lésions 5 à 7 jours après l’inoculation. La méthode d’examen est la même que pour la méthode d’inoculation par pulvérisation (voir l’étape 1.3.13).
- Examiner les brins de riz et d’orge malades de ~6 cm de longueur et les photographier pour évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6cm2.
