SYSTÈME DE RAPPORTEUR DE VIRUS RECOMBINANT IN VITRO POUR LA DÉTECTION D’UNE INFECTION VIRALE

Résumé

Source : Nishitsuji, H., et al. Développement d’un système de rapporteur du virus de l’hépatite B pour surveiller les premières étapes du cycle de réplication. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo présente une technique in vitro pour détecter l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) via un système rapporteur recombinant du VHB. Lorsqu’il infecte les cellules hôtes, le génome viral recombinant exprime l’enzyme rapporteure de la luciférase, qui produit une bioluminescence lors de l’oxydation de son substrat, ce qui aide à détecter l’infection virale.

Protocole

1. Production de VHB recombinant codant pour la protéine rapporteure

1. Préparation des cellules HepG2
   1. Préparez un milieu de culture cellulaire (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco ou DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 100 U/ml d'acides aminés non essentiels.
   2. Plaquez 4 x 10⁶ cellules d’HepG2 dans une boîte de 10 cm enduite de collagène dans 10 ml de milieu de culture la veille de la transfection. Incuber des cellules HepG2 à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂.
      note: Lorsqu’environ 4 x 10⁶ cellules HepG2 sont placées dans une boîte de 10 cm recouverte de collagène dans 10 ml de milieu de culture, elles seront confluentes à 70-90 % le lendemain.
2. transfection
   1. Transfectez les cellules HepG2 avec 5 μg de pUC1.2HBV (virus de l'hépatite B) delta epsilon et 5 μg de pUC1.2HBV/NL15 à l'aide d'un réactif de transfection conformément aux instructions du fabricant.
   2. Le lendemain, retirez le milieu de culture et ajoutez 10 ml de milieu de culture frais.
   3. Une semaine après la transfection, transférez le milieu de culture contenant le VHB recombinant dans un tube de 50 ml et passez à l’étape 1.3.1. Ajouter 10 ml de milieu de culture frais dans la plaque contenant les cellules transfectées.
      note: La production du VHB recombinant est maintenue pendant 4 semaines. Le milieu de culture contenant le VHB recombinant peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois.
3. Purification du VHB recombinant
   1. Retirer les débris cellulaires du milieu de culture contenant le VHB recombinant par centrifugation (2 300 x g pendant 5 min).
   2. Passez le surnageant à travers un filtre à membrane de 0,45 μm.
   3. Ajouter un volume égal de 26 % de PEG/1,5 M de NaCl (polyéthylène glycol 6000 : 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml de 0,5 M d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) pH 8,0 et 5 ml de 1 M HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique) (pH 7,6 dans 500 ml) au milieu de culture contenant le VHB recombinant et mélanger délicatement. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   4. Centrifugeuse à 2 300 x g pendant 20 min à 4 °C.
   5. Jeter le surnageant et dissoudre la pastille dans 0,5 ml de TNE (10 mM de Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane), 50 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA).
   6. Retirer les débris par centrifugation à 2 300 x g pendant 5 min.
   7. Charger 0,5 ml d’ENT contenant du VHB recombinant sur 0,8 ml de saccharose à 20 % d’ENT.
   8. Centrifugeuse à 100 000 × g pendant 3 h à 15 °C.
   9. Jetez autant de surnageant que possible et conservez la pastille. Le remettre en suspension dans 1 ml de DMEM sans sérum pour 40 ml de milieu de culture de départ.
   10. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   11. Filtrez à travers un filtre de 0,45 μm. Préparez 0,5 ml d’aliquotes et conservez-les à -80 °C.
       note: Si l’on observe une contamination de l’échantillon viral d’origine par des protéines rapporteures, purifier le virus par ultracentrifugation à gradient de densité de 5 à 30 % de saccharose dans TNE à 100 000 x g pendant 2 heures, ou par centrifugation équilibrée par densité CsCl de 1,1 à 1,6 g/ml à 150 000 x g pendant 50 heures.

2. Infection par le VHB recombinant

1. Cultivez des cellules HepG2 exprimant de manière stable le NTCP (polypeptide co-transportant le taurocholate de sodium) (HepG2/NTCP) qui sont sensibles à l’infection par le VHB dans le DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 250 μg/ml de G-418 (généticine) et 100 U/ml d’acides aminés non essentiels à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂.
2. La veille de l’infection, mettre en boîte environ 5 x 10⁴ cellules HepG2/NTCP dans une plaque recouverte de collagène à 96 puits dans 0,1 ml de milieu de culture.
3. Décongeler le VHB recombinant dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il reste un peu de glace dans le flacon.
4. Préparez le milieu pour l’infection en combinant les éléments suivants : 10 μl de PEG8000 à 40 % dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 2 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO), 10 μl de VHB recombinant et 78 μl de milieu de culture frais par puits d’une plaque de 96 puits.
5. Ajouter 100 μl de solution recombinante de VHB dans un puits de la plaque à 96 puits.
6. Un jour après l’infection, laver les cellules infectées 3 fois avec 300 μl de PBS par puits pour éliminer la protéine rapporteure contaminante de la fraction virale.
7. Incuber les cellules infectées dans 200 μl de milieu de culture contenant 2 % de DMSO pendant une semaine ou moins.

3. Analyse

1. Une semaine après l’infection, lavez les cellules infectées 3 fois avec du PBS.
2. Ajoutez 50 μl de tampon de lyse aux cellules infectées.
3. Secouez la plaque de culture pendant 5 min, puis centrifugez à 2 000 x g pendant 5 min.
4. Ajoutez 50 μl de substrat rapporteur dans la plaque du luminomètre.
5. Ajouter 20 μl de lysat cellulaire sur une plaque de luminomètre contenant le substrat rapporteur. Mélanger par vortex brièvement.
6. Placez la plaque dans le luminomètre et lancez la lecture.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Régent de dosage de la luciférase Nano-Glo	Promega	N1110
Solution mixte pénicilline-streptomycine	Nacalai tesque	Référence 09367-34
Solution d’acides aminés non essentiels MEM	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Sérum Réduit Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
Plat de 100 mm/enduit de collagène	Iwaki	Référence 4020-010
Lipofectamine 3000 Réactif de transfection	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyéthylène glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	Référence 81255
Polyéthylène glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	Référence 89510
NaCl	Nacalai tesque	Référence 31319-45
Solution 0,5 mol/l-EDTA	Nacalai tesque	Référence 06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	Référence 35434-21
Millex-HP, 0,45 μm, polyéthéthersulfone, filtre	Merck Millipore	SLHP033RS
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Plaque à 96 puits recouverte de collagène	Corning	N° NO3585
Lyse passive 5xBuffer	Promega	E1941
Luminomètre sur microplaques GloMax 96	Promega	E6501
saccharose	Nacalai tesque	Référence 30403-55
Plaque luminomètre	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
Tube de 50 ml	Violamo	Référence 1-3500-02
Anticorps anti-Myc	Sigma-Aldrich	Réf. C3956
HBIG	Organisation japonaise des produits sanguins	-
IFN-β	Mochida Pharmaceutique	1,49872E+13
héparine	Sigma-Aldrich	N° H3393