Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Solutions requises
- Préparez 150 mg/L (pour l’anesthésie) ou 300 mg/L (pour l’euthanasie) d’une solution de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (MS-222) avec de l’eau de l’aquarium où les poissons-zèbres sont maintenus. Remplissez un petit réservoir avec 1 L de solution anesthésique et maintenez-le aéré.
- Remplissez un autre petit réservoir avec 1 L d’eau d’aquarium sans MS-222 pour la récupération des poissons et maintenez-le aéré.
- Préparez 50 mL de 1x PBS à partir d’une solution mère stérile 10x.
- Pour l'analyse cytométrique ou l'isolement des cellules intestinales, préparer une solution fraîche de collagénase de type IV à 0,15 % pour 1 ml par poisson à partir d'une solution mère ou de poudre dans un milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 1 % v/v de pénicilline et de streptomycine (voir les documents). Faire des aliquotes (1 par poisson) de 1 mL dans des tubes à centrifuger de 2 mL. Conserver à 4 °C jusqu’à 30 min avant l’étape de dissection.
- Pour la microscopie confocale/fixation d’échantillons, préparer 50 mL d’une solution fraîche de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS ou décongeler une solution mère d’un congélateur à -20 °C dans une hotte.
prudence: Le PFA est toxique. Veuillez lire la fiche de données de sécurité avant de l’utiliser. Il faut porter des gants et des lunettes de sécurité, et toujours laisser les solutions à l’intérieur d’une hotte.
2. Préparation de l’équipement pour l’intubation orale
- Placez environ 1 cm d’un tube en silicone fin sur une aiguille Luer lock de 31 G pour couvrir la pointe de l’aiguille.
- Découpez une pointe de pipette filtrante stérile de 10 μL (environ 2 cm), prenez l’extrémité la plus fine et placez-la sur le tube en silicone comme une gaine. Assurez-vous que la pipette dépasse de la pointe de l’aiguille pour éviter de blesser l’animal.
- Fixez l’aiguille à une seringue Luer lock de 100 μL.
note: Rincez toujours abondamment à l’éthanol puis à la solution saline tamponnée au phosphate (PBS, voir Matériaux) entre les traitements.
3. Préparation de la suspension de nanoparticules fluorescentes
- Étiquetez la nanoparticule protéique avec l'ester NHS Atto-488 (voir le tableau des matériaux) ou un colorant fluorescent approprié selon les instructions du fabricant.
- Remettre les nanoparticules en suspension dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 M à la concentration de 2 mg/mL.
- Dissoudre l’ester Atto 488 NHS dans du diméthylsulfoxyde sans amine (DMSO) à 2 mg/mL. Conservez une aliquote de 10 μL pour vérifier l’efficacité de l’étiquetage.
- Mélangez les nanoparticules et l’ester NHS Atto 488 à un rapport molaire de 1:2 (protéine :colorant) en remuant dans l’obscurité.
- Faites tourner les nanoparticules marquées par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante, retirez le surnageant et conservez-le pour vérifier l’efficacité de l’étiquetage.
- Lavez les nanoparticules marquées en les remettant en suspension dans 1 mL de tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M par vortex et pipetage de haut en bas. Jeter ensuite le surnageant par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Répétez l’étape 3.6 5 fois.
- Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M dans un tube à centrifuger de 15 mL et faire des aliquotes de la nanoparticule fluorescente dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL (30 aliquotes). Faites tourner à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante, jetez le surnageant et conservez-le à -80 °C à l’abri de la lumière.
4. Anesthésie et intubation orale du poisson-zèbre
- Faites jeûner le poisson (>0,5 g) au moins 48 heures avant l’expérience pour vider l’intestin.
- Déplacez les poissons (12 poissons) dans les bassins expérimentaux (6 L) une nuit avant l’expérience pour permettre l’acclimatation12.
- Tourbillonnez bien la solution de nanoparticules (par exemple, 2 500 tr/min et 30 s) et aspirez le volume souhaité de suspension de nanoparticules (par exemple, 20 à 50 μL) dans la seringue fixée à l’aiguille protégée.
- Placez les poissons dans la solution aérée de MS-222 à 150 mg/L (voir section 1) jusqu’à ce qu’ils coulent au fond de l’aquarium et qu’ils ne répondent pas à un pincement de la nageoire caudale ; ce processus prend moins de 5 min.
- Transférez rapidement le poisson anesthésié à l’aide d’un filet dans un plateau en plastique humide, orientez l’animal horizontalement pour faire face à l’aiguille et commencez immédiatement l’intubation orale.
- Soutenez soigneusement le poisson d’une main et ouvrez la bouche de l’autre main à l’aide de l’aiguille protégée. Insérez doucement l’aiguille dans l’œsophage jusqu’à environ 1 cm de l’ouverture de la bouche.
note: L’opérateur peut ressentir une légère résistance lorsque l’extrémité de la pointe de la pipette a dépassé la branchie. Veillez à ne pas trop incliner l’entrée de l’aiguille qui pourrait perforer les branchies.
- Injectez lentement la suspension de nanoparticules dans le poisson. Assurez-vous que la suspension ne s’écoule pas vers l’extérieur par les branchies ou la bouche.
- Retirez délicatement l’aiguille et placez le poisson dans le réservoir de récupération (voir section 1). La récupération prend généralement 1 minute.
- Vérifiez soigneusement le poisson pour toute anomalie (par exemple, un saignement au niveau des branchies est un signe de perforation).
- Une fois que les poissons se sont rétablis, remettez-les dans les bassins expérimentaux.
