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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Anesthésier, intuber et inoculer des animaux
REMARQUE : Il est recommandé de recevoir des rats Sprague-Dawley mâles immunocompétents exempts d’agents pathogènes spécifiques (FPS) pesant de 100 à 120 g. Fournissez à tous les animaux de la nourriture et de l’eau à volonté et hébergez-les socialement sur des copeaux de bois ou une autre litière absorbante avec des cycles standard de 12 heures de lumière et d’obscurité.
- Avant de mener toute expérience, procurez-vous et stérilisez une canule métallique et un tube en polyéthylène de la taille appropriée pour l’espèce animale. Procurez-vous des seringues jetables stériles de 1 ml et des aiguilles stériles jetables de calibre 25.
prudence: Jetez toujours ces seringues et aiguilles dans un contenant pour objets tranchants.
- Pour les rats, achetez ou fabriquez une canule métallique d’environ 12 cm de longueur, d’un diamètre intérieur de 0,9 à 1,0 mm et d’un diamètre extérieur de 1,0 à 1,2 mm et d’un angle d’environ 45° à une extrémité. Coupez une longueur de tube en polyéthylène de 11 à 12 pouces avec un diamètre intérieur de 0,4 mm et un diamètre extérieur de 0,8 mm. (Reportez-vous à la figure 1A.)
- Placez la canule métallique dans un tube en verre, à bouchon à vis et autoclave selon les méthodes standard de stérilisation. Faites tremper et stockez les longueurs coupées du tube en polyéthylène dans un bécher couvert contenant de l’alcool.
- Préparez la surface de travail et le dispositif d’intubation.
- Placez un tapis jetable propre sur le plan de travail, près du bain-marie. Transférez la canule métallique, dans son tube de stockage en verre, sur cette surface. Retirez le capuchon du tube de stockage et faites glisser l’extrémité « poignée » de la canule vers l’extrémité ouverte du tube.
- À l’aide d’une pince stérile, retirez une longueur de tube en polyéthylène du bécher et insérez-la à l’intérieur de la canule métallique stérile, en vous assurant qu’elle se déplace librement. Insérer une aiguille stérile jetable de calibre 25 (pour rats) sur l’extrémité libre du tube en polyéthylène en glissant l’aiguille sur plusieurs mm dans le tube. (Reportez-vous à la figure 1A pour les rats).
- Placez des repères sur la canule métallique et le tube en polyéthylène pour indiquer la profondeur d’insertion chez l’animal en suivant la procédure d’intubation décrite ci-dessous sur un seul animal euthanasié. Ouvrez la cavité thoracique pour l’observation, puis placez correctement la canule métallique et avancez le tube en polyéthylène de manière appropriée. À l’aide d’un stylo indélébile, marquez la canule métallique à l’endroit où elle rencontre la bouche de l’animal et le tube en polyéthylène à l’endroit où elle rencontre le haut de la canule métallique pour faciliter la mise en place chez les autres animaux.
- À l’intérieur d’une hotte (ou à l’aide d’un système de balayage approprié), anesthésier jusqu’à 6 animaux à la fois dans une chambre fermée alimentée en isoflurane à ≤5 % dans 1,5 L/min d’oxygène jusqu’à ce que le réflexe nauséeux soit inhibé (environ 1 min).
note: Avant de mener toute expérience, établir la dose sécuritaire et la durée d’exposition à l’isoflurane dans les conditions particulières utilisées (p. ex., taille/type de chambre et taille/espèce/souche de l’animal) afin de prévenir une exposition létale par inadvertance.
- Remplissez une seringue stérile jetable de 1 mL (pour les rats) avec une solution saline stérile en plaçant l’embout stérile dans la solution saline et en la tirant sur le piston. Fixez la seringue à l’aiguille fixée sur le tube en polyéthylène et rincez tout le volume de solution saline à travers le tube jusqu’à ce que la seringue soit vidée.
- Remplissez la seringue avec l’inoculum à base de gélose du récipient dans le bain-marie et rincez la gélose à travers le tube jusqu’à ce que le tube soit amorcé (par exemple, complètement rempli de gélose).
- Pour les rats, retirez l’aiguille de calibre 25 (fixée sur le tube en polyéthylène) de la seringue jetable. Jetez la seringue usagée dans un récipient pour objets tranchants. Remplissez une nouvelle seringue stérile jetable de 1 ml avec l’inoculum à base d’agar du récipient dans le bain-marie en plaçant l’embout stérile dans l’inoculum et en tirant sur le piston. Rattachez l’aiguille (montée sur le tube en polyéthylène) et rincez la gélose à travers le tube en appuyant sur le piston jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli de gélose.
- Retirez un animal de la chambre d’anesthésie. Placez l’animal en position couchée sur le tapis jetable, la tête à droite et la queue à gauche, comme illustré à la figure 1C.
- À l’aide du dispositif d’intubation (c’est-à-dire la canule métallique munie d’un tube en polyéthylène), intubez l’animal et insérez la canule dans le grand lobe du poumon gauche (voir figure 1D).
- Insérez l'extrémité libre de la canule métallique dans la gueule de l'animal. Tournez la canule de manière à ce que l’extrémité libre soit inclinée vers le haut et avancez-la doucement dans la trachée, en contournant soigneusement les structures laryngées avec un léger mouvement de torsion. Confirmez l’insertion dans la trachée plutôt que dans l’œsophage en faisant glisser doucement la canule légèrement vers l’avant et vers l’arrière à plusieurs reprises tout en palpant les anneaux trachéaux avec l’index gauche, comme le montre la figure 1C.
- Lorsque la canule atteint la bifurcation où la trachée se divise en bronches gauche et droite, effectuez un léger mouvement de torsion vers le côté gauche de l'animal pour vous assurer que la canule est insérée dans la bronche gauche. Avancez la canule métallique jusqu’à ce que l’extrémité soit à mi-chemin des trois quarts du poumon gauche, en utilisant le repère précédemment placé pour confirmer que la profondeur appropriée a été atteinte.
- Une fois la canule métallique en place, avancez le tube en polyéthylène de plusieurs mm. Utilisez le repère précédemment placé sur le tube pour vous assurer qu’il n’est avancé que suffisamment loin pour sortir de l’extrémité de la canule métallique et ne pas perforer le poumon.
- Une fois les deux canules en place, à l’aide de la seringue ci-jointe, instiller 100 μL (pour les rats) de la suspension de gélose profondément dans le gros lobe du poumon gauche (voir la figure 1D). Prélever plusieurs mm de la tubulure en polyéthylène, puis retirer délicatement le dispositif d’intubation intact. Remettez-le dans le tube de stockage en verre et placez l’animal dans une cage fraîche pour récupérer.
