Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’extrait de glande lacrymale
REMARQUE : Des rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine (75 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Une anesthésie appropriée a été confirmée par un pincement des orteils et de la queue. Un gel ophtalmique a été appliqué sur les yeux du rat pour prévenir la sécheresse après chaque procédure. Les rats anesthésiés ont été placés sous des lumières infrarouges lointaines pour garder les animaux au chaud jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement. Pendant les procédures et le temps de récupération, les animaux ont été étroitement surveillés par les chercheurs. Tout le matériel et les outils chirurgicaux étaient stériles avant d’être utilisés. À la fin de l’expérience, des rats ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (80 mg/kg). L’euthanasie complète a été vérifiée par l’absence de pouls cardiaque et l’absence de réflexe de clignement des yeux en touchant le globe oculaire. Les rats ont été logés dans des conditions standard : température ambiante, 21-23 °C ; humidité relative, 30-70 %; cycle lumière-obscurité, en alternance 12 h (7 h à 19 h).
- Placez les rats femelles Sprague-Dawley euthanasiés (âgés de 8 semaines à 16 semaines) à plat, une oreille contre la table et l’autre vers le haut. Faites une incision de 10 mm en haut-bas sous l’oreille exposée avec une paire de ciseaux à ressort. Retirez la glande lacrymale en la disséquant du tissu conjonctif environnant et du canal de drainage.
- Stockez les glandes à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Décongeler les glandes sur la glace. Hacher le plus finement possible sur de la glace à l’aide de ciseaux. Ajouter 150 μL de PBS avec 1x inhibiteur de protéase par glande lacrymale.
- Sonicez les échantillons sur de la glace pendant 5 min à 20 kHz avec le sonicateur réglé à 10 s sous tension et 10 s hors tension à 30 % d’amplitude. Centrifuger les échantillons soniqués pendant 20 min à 13 000 x g et 4 °C.
- Pipetez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube. Aliquote le surnageant dans des tubes de 1,5 mL et conservez-les à -80 °C. Mesurez la concentration de protéines à l'aide d'un dosage de l'acide bicinchoninique, conformément aux instructions du fabricant.
2. Préparation de l’émulsion et de la toxine coquelucheuse
- émulsion
- Ajouter 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra tué par la chaleur dans 10 mL d'adjuvant complet de Freund contenant 1 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra et bien mélanger.
note: Le dernier adjuvant complet de Freund contient 5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Pesez l’ovalbumine, dissolvez-la dans du PBS et préparez un mélange d’antigènes contenant 2 mg/mL d’ovalbumine et 10 mg/mL d’extrait de glande lacrymale. En visant un volume d’injection de 200 μL pour chaque animal, préparez un mélange maître basé sur le nombre d’animaux.
- Transférez l'adjuvant de Freund incomplet ou l'adjuvant de Freund complet dans un tube de 50 ml, en veillant à ce que le volume de l'adjuvant par rapport au mélange d'antigènes soit dans un rapport de 1:1. Ajouter le mélange d’antigènes goutte à goutte à l’adjuvant tout en tourbillonnant à la vitesse la plus élevée afin de ne pas entraîner de déversement. Continuez à vortex pendant 5 minutes après avoir ajouté tout l’antigène.
- Transférez l’émulsion dans une seringue de 5 ml et reliez-la à une autre seringue de 5 ml à l’aide d’un connecteur de seringue. Poussez l’émulsion d’une seringue à l’autre pour la mélanger.
note: L’émulsion est prête si une seule gouttelette reste sous forme de sphère lorsqu’elle est placée dans l’eau. Seule une émulsion fraîchement préparée ou une émulsion conservée toute la nuit à 4 °C doit être utilisée.
- Toxine coqueluche
- Reconstituez 50 μg de toxine coquelucheuse dans 500 μL d’eau pour obtenir une concentration finale de 100 ng/μL. Votex le récipient pendant 30 secondes pour vous assurer que la toxine se dissout complètement.
note: Ne pas stériliser par filtration, car cela entraînerait une perte de matière. Ne pas congeler. Cette solution reste active pendant au moins 6 mois à 4 °C.
- Diluer 100 ng/μL de toxine coquelucheuse à 3 ng/μL à l’aide de PBS. Transvaser 100 μL de toxine coquelucheuse diluée dans une seringue d’injection Luer-lock de 1 mL à l’aide d’une aiguille de 27 g.
3. Immunisation des rats Lewis
- Le jour 0, mélangez l’émulsion plusieurs fois. Répartir 200 μL de l'émulsion, qui contient 1 mg d'extrait de glande lacrymale et 200 μg d'ovalbumine dans l'adjuvant de Freund complet, dans des seringues Luer-lock de 1 mL avec des aiguilles de 27 G. Injecter l’émulsion par voie sous-cutanée à la base des queues de rat sans anesthésie.
note: La queue n’a pas besoin d’être préchauffée avant l’injection. Chaque rat est immunisé avec 1 mg d'extrait de glande lacrymale et 200 g d'ovalbumine dans l'adjuvant de Freund complet avec 500 g de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Le 14e jour, injecter 200 μL de l'émulsion, qui contient 1 mg d'extrait de glande lacrymale et 200 μg d'ovalbumine dans un adjuvant de Freund incomplet, de la même manière qu'au jour 0. Injecter 300 ng de toxine coquelucheuse dans 100 μL de PBS par voie intrapéritonéale par rat le même jour.
4. Injection du mélange d’antigènes dans la sous-conjonctive fornicéale et la glande lacrymale pour recruter des cellules immunitaires spécifiques de l’antigène et provoquer une inflammation locale
- Calculez la quantité d’ovalbumine et d’extrait de glande lacrymale en fonction du nombre de rats dans l’expérience. Pesez la quantité requise d’ovalbumine et combinez-la avec l’extrait de glande lacrymale décongelé préparé à l’étape 1, en faisant une solution antigénique contenant 1 mg/mL d’ovalbumine et 1 mg/mL d’extrait de glande lacrymale.
- Anesthésier les rats avec de la kétamine (75 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Pincez les orteils des rats pour vous assurer que l’anesthésie est correcte (c.-à-d. qu’aucun mouvement réactif n’est observé après le pincement). Injecter 5 μL d’antigène dans la sous-conjonctive fornicéenne de l’œil. Injecter 20 μL d’antigène dans la glande lacrymale.
