Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Ensemencement des cellules péritonéales dans les lames de canaux
- Après avoir pipeté la suspension de cellules de macrophages de souris péritonéales de haut en bas pour réduire l’agglutination, pipetez la suspension de 100 μL dans le canal prérempli (volume, 100 μL) d’une lame de canal enrobée de fibronectine (un canal de 100 μL a les dimensions (longueur x largeur x hauteur) : 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Préremplissez la chambre en ajoutant 1 mL de milieu RPMI 1640 (Hepes) complété par du sérum dans l’un des deux réservoirs de la lame du canal, en inclinant la lame, puis en aspirant le milieu à partir du réservoir en aval (figure 1).
- Éliminez les bulles d’air indésirables, ou les longues bandes d’air, dans le canal en ajoutant 1 à 2 ml de fluide dans l’un des deux réservoirs, en appliquant fermement un bouchon de réservoir, puis en pompant l’air par une pression rythmique du pouce sur le capuchon et, si nécessaire, en inclinant la glissière. Après avoir expulsé l’air, inclinez la glissière avec le réservoir non bouché (et contenant le fluide) vers le bas avant de retirer le capuchon pour éviter que l’air ne soit aspiré dans le canal.
- Incuber la lame de canal, ensemencée avec des cellules, dans une chambre humide pendant 2 h à 37 °C en l’absence de CO2 (le CO2 n’est pas nécessaire puisque le système tampon HCO3-/CO2 est remplacé par Hepes). Les glissières de canal peuvent être placées de manière pratique sur un support qui contient huit diapositives. En règle générale, 6 à 8 diapositives sont préparées à partir d’une souris, bien qu’il soit possible d’en préparer jusqu’à 10 ou plus.
- Retirez le support et remplacez le milieu RPMI 1640 (Hepes) dans chaque lame par le milieu RPMI 1640 contenant du bicarbonate, complété par 10 % de sérum fœtal bovin, ainsi que de la pénicilline/streptomycine.
- Inclinez la glissière et aspirez le fluide d’abord à partir du réservoir inférieur, puis à partir du réservoir supérieur. Ensuite, ajoutez 1 ml du nouveau fluide dans l’un des réservoirs, inclinez la glissière et aspirez le fluide du réservoir en aval, après qu’il se soit écoulé dans le canal.
- Après cette étape de lavage (échange de fluide), remplissez la glissière du canal en ajoutant 1 mL de fluide dans l’un des réservoirs.
note: Les étapes de lavage à l’aide de lames de canal sont très simples et efficaces en termes d’échange de solution et d’élimination des cellules non adhérentes. Notez que le milieu RPMI 1640 (bicarbonate) est normalement pré-incubé avec 5 % de CO2 pendant la nuit pour assurer l’équilibre thermique et le pH.
- Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Effectuez des expériences le lendemain.
2. Isolement des globules rouges humains
- Le deuxième jour (le deuxième jour des expériences, après l’incubation pendant la nuit des macrophages péritonéaux isolés), prélever 1 à 2 ml de sang veineux périphérique d’un donneur sain, dans un tube hépariné. Transvaser 1 mL dans un tube de microcentrifugation à fond rond de 2,0 mL (polypropylène), centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 18 °C (réglage empirique) et retirer le surnageant (plasma et couche leucocytaire).
- Aspirez doucement 100 μL de globules rouges sédimentés et mélangez ce volume 1:1 avec du milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié (décrit ci-dessous) dans un tube de microcentrifugation à fond rond de 2,0 mL. Étiquetez le tube « 1:1 ».
note: Le milieu RPMI 1640 (Hepes) utilisé le jour 2 (pour les dosages) après l’isolement des cellules contient, en plus de 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, de la pénicilline (100 unités/mL), de la streptomycine (100 μg/mL) et 1 mM de N-(2-mercaptopropionyl)glycine (pour réduire la phototoxicité). Ci-après, ce support est appelé support RPMI 1640 (Hepes) « modifié ».
- Pipeter 4 μL de suspension diluée de globules rouges 1:1 dans un milieu RPMI 1640 modifié (Hepes) de 2 mL, pré-pipetté dans un tube de microcentrifugation de 2,0 mL (répéter cette étape, c’est-à-dire préparer 2 tubes). Étiquetez chaque tube « 4:2000 ». Placez les tubes « 1:1 » et « 4:2000 » sur de la glace.
3. Marquage de la membrane plasmique des macrophages
- Retirer les lames de rainure ensemencée de l’incubateur de CO2 et remplacer le milieu RPMI 1640 (bicarbonate) de chaque lame par un milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Ensuite, placez les cellules dans une chambre humide à 37 °C en l’absence de CO2.
note: Après une nuit d’incubation et de lavage, la plupart des lymphocytes sont retirés du canal. La majorité des cellules adhérentes restantes sont des macrophages, qui peuvent être identifiés soit morphologiquement, soit par coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps anti-F4/80. Environ 95 % des macrophages péritonéaux résidents de souris sont positifs pour la valeur F4/80.
- Diluer l’anticorps anti-souris F4/80 marqué en vert fluorescent (stocké à 4 °C) 1:40 dans un milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Prenez une lame, inclinez-la et pipetez (goutte à goutte) 100 μL du mélange d’anticorps dans l’ouverture du canal de 100 μL de la lame (voir Figure 1). Fluide aspirant qui s’écoule dans le réservoir aval. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C (environnement humidifié, sans CO2). Pendant la période d’incubation, étiqueter les globules rouges humains (voir rubrique 5).
note: Comme nous l’avons mentionné ci-dessus, le CO2 n’est pas nécessaire puisque le système tampon HCO3-/CO2 est remplacé par Hepes.
- Après un temps d’incubation de 20 minutes (au cours duquel les globules rouges humains sont colorés et opsonisés), laver la lame en ajoutant 1 mL de milieu RPMI 1640 modifié (Hepes) à l’un des réservoirs et en aspirant le milieu après qu’il se soit écoulé dans le canal, facilité par l’inclinaison de la lame. Ajouter 1 mL de milieu pour un stockage à court terme ou procéder à une expérience (c.-à-d. pipetage de particules (globules rouges opsonisés) et imagerie de la phagocytose par microscopie confocale à disque rotatif en accéléré).
4. Marquage de la membrane plasmique des globules rouges humains
- Commencer le marquage des globules rouges humains immédiatement après l’incubation d’une lame de macrophages avec un anticorps anti-F4/80 marqué par fluorescence verte (après la section 3.2). Après un mélange doux, prélever 400 μL de l’un des tubes « 4:2000 » (voir section 2.3) et le distribuer dans un tube de microcentrifugation (à fond rond) de 2,0 mL. Laissez le temps à la suspension de se réchauffer à environ 37 °C (voir paragraphe ci-dessous). Ajouter 0,4 μL de colorant à membrane plasma fluorescente orange/rouge (aliquotes stockées à -20 °C), mélanger et incuber à 37 °C pendant 5 min
note: Un bloc d’aluminium chauffé, placé à l’intérieur de la hotte à flux laminaire, est utile pour minimiser les pertes de chaleur lors de la préparation des diapositives. Les tubes peuvent être placés dans les puits de forage du bloc chauffant et une plaque d’aluminium chauffée séparée ou intégrée peut servir d’espace de travail.
- Après la période d’incubation de 5 minutes, préparez la première étape de lavage en ajoutant 1600 μL de milieu RPMI 1640 modifié (Hepes) (pour remplir le tube de microcentrifugation de 2,0 mL).
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 18 °C (réglage empirique). Une pastille rouge compacte doit être visible sur le mur (c’est-à-dire décentrée) au bas du tube. Faites pivoter le tube de manière à ce que la pastille soit tournée vers le haut et retirez soigneusement tout le surnageant successivement (en deux étapes) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 ml.
- Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez 2 000 μL de milieu RPMI 1640 modifié (Hepes), mélangez (pour remettre les cellules en suspension) et répétez les étapes de centrifugation et d’aspiration du surnageant ci-dessus.
- Remettre en suspension la pastille (de globules rouges colorés par membrane plasmique et 2x lavés) avec 400 μL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Étiquetez le tube PMS (abréviation de coloration à membrane plasmique).
note: Alternativement, l’ester succinimidylique d’un dérivé de la rhodamine sensible au pH, qui devient plus fortement fluorescent au pH acide, pourrait être utilisé pour marquer les globules rouges humains. Dans ce cas, l’intensité de fluorescence sert en outre de mesure de la maturation des phagosomes après l’internalisation des particules.
5. Opsonisation (marquage) des globules rouges humains avec l’immunoglobuline G de souris (IgG)
- Ajouter 1 μL d’anticorps monoclonaux (IgG2b) anti-CD235a (1 mg/mL) de souris (clone HIR2) (conservés à -20 °C) dans le tube étiqueté PMS (voir rubriques 4.2 à 4.5), contenant des globules rouges humains colorés par membrane plasmique en suspension dans un milieu de 400 μL. CD235a (également connue sous le nom de glycophorine A) est une sialoglycoprotéine membranaire spécifique de la lignée érythroïde.
- Incuber à 37 °C pendant 8 min. Notez que l’opsonisation des globules rouges humains avec des IgG provoque une agglutination (agglutination cellulaire). Bien que l’agglutination puisse servir d’indicateur visuel d’opsonisation, elle n’est pas souhaitable pour l’imagerie d’effets phagocytaires uniques. Pour éviter l’agglutination, mélangez à plusieurs reprises la suspension cellulaire (toutes les 1 min) à l’aide, par exemple, d’une pipette à volume variable de 20 à 200 μL réglée sur 200 μL.
- Vers la fin de la période d’incubation de 8 minutes, si vous le souhaitez, laver la lame de macrophage, incubée avec un anticorps anti-F4/80 marqué par fluorescence verte, avec 1 mL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Assurez-vous que les deux réservoirs de la glissière du canal sont exempts de fluide après les étapes de lavage.
6. Imagerie de la phagocytose des globules rouges humains colorés par membrane plasmique et enrobés d’IgG
- Après l’incubation de 8 minutes avec un anticorps anti-CD235a (section 5.2), pipeter une suspension de 100 μL contenant des globules rouges humains colorés par membrane plasmique et opsonisés par IgG dans le canal d’une lame contenant des macrophages marqués avec un anticorps anti-F4/80 fluorescent vert (étape 3). Ainsi, des globules rouges humains fluorescents rouges et opsonisés en IgG sont ajoutés à des phagocytes fluorescents verts (macrophages).
- Dès que des globules rouges humains ont été ajoutés, montez la lame de canal sur un microscope confocal à disque rotatif (avec l’incubateur de platine réglé à 37 °C) pour l’imagerie, par exemple, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60X/1,49. Démarrez l’imagerie dès que possible, car les particules commencent à se déposer en 1 min.
note: À l’aide de billes fluorescentes d’un diamètre de 100 nm, nous avons mesuré, par analyse des fonctions d’étalement du point, des résolutions XY de x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (laser 488 nm) et x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (laser 561 nm). Cependant, pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité lors de l’imagerie 3D en accéléré de cellules vivantes, nous compromettons la résolution spatiale en utilisant le binning 2 x 2. Le binning augmente la sensibilité (améliore le rapport signal/bruit) et la fréquence d’images autorisée, mais au détriment de la résolution spatiale.
- Utilisez un système de mise au point parfaite (ou similaire) pour éviter la dérive de la mise au point pendant les enregistrements. Après avoir activé le système de mise au point parfaite, utilisez la commande de décalage pour faire la mise au point sur les saillies lamellipodiales des macrophages immédiatement au-dessus de la lamelle (voir note ci-dessous) de la diapositive du canal. Ce niveau de focalisation correspond à Z = 0 μm. Obtenez des empilements Z de -1 μm à +16 μm par pas de 0,8 μm, ce qui équivaut à 22 tranches Z. Les piles Z peuvent par exemple être obtenues à raison de 1 pile (pour chaque canal) toutes les 15 s pour un total de 16 min
note: Les périodes d’enregistrement plus longues souffrent de pertes de qualité d’image, principalement dues au photoblanchiment. Les piles Z sont acquises pour chacun des deux canaux : les macrophages sont imagés à l’aide d’un laser de 488 nm (canal vert) et les globules rouges humains sont imagés à l’aide d’un laser de 561 nm (canal rouge). En utilisant cette approche, diverses vues de macrophages ingérant des globules rouges humains opsonisés en IgG à différents moments peuvent être obtenues (par exemple, voir la figure 2).
note: Les paramètres typiques du système (avec binning 2 x 2) sont les suivants : canal vert (puissance laser de 20,5 % (50 mW ; 488 nm), sensibilité de 101 (plage, 0-255) et temps d’exposition de 200 ms) ; canal rouge (puissance laser de 10,5 % (50 mW ; 561 nm), sensibilité de 101 (plage, 0-255) et temps d’exposition de 98 ms).
note: Le fond de la glissière du canal est un polymère de la même épaisseur qu’une lamelle en verre #1.5 et des mêmes propriétés optiques que le verre, mais, notamment, le matériau présente l’avantage de la perméabilité aux gaz.
