Coloration à l’acétoxyméthyle de calcéine pour évaluer la cytotoxicité médiée par les cellules tueuses naturelles envers les cellules cancéreuses

Résumé

Source : Chava, S. et al., Mesure de la cytotoxicité et de la migration médiées par les cellules tueuses naturelles dans le contexte des cellules tumorales hépatiques. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente un test permettant de mesurer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles contre les cellules cancéreuses à l’aide de la coloration Calcein AM. Le nombre réduit de cellules cancéreuses fluorescentes suite à une co-culture avec des cellules tueuses naturelles indique une cytotoxicité médiée par les cellules tueuses naturelles envers les cellules cancéreuses.

Protocole

1. Méthode microscopique basée sur la coloration Calcein AM pour mesurer la cytotoxicité à médiation cellulaire NK

1. Cultiver des cellules SK-HEP-1 à une confluence de 70 à 80 %. Générer une suspension unicellulaire en lavant d’abord les cellules avec 5 mL de 1x PBS suivi d’une incubation avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 %.
2. Centrifugez les cellules SK-HEP-1 dans un tube à centrifuger stérile de 1 mL à 160 x g pendant 3 min. Remettez la pastille en suspension dans 3 mL de DMEM sans sérum.
3. Ajouter 1,5 μL de solution de calcéine AM (10 mM) dans les cellules SK-HEP-1 et incuber pendant 30 min à température ambiante. Centrifuger les cellules SK-HEP-1 marquées à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugation stérile de 15 mL.
4. Lavez les cellules deux fois avec 5 ml de 1x PBS pour éliminer l’excès de colorant AM de calcéine.
5. En parallèle, centrifuger les cellules NK92MI à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugation stérile de 15 mL. Lavez la pastille cellulaire une fois avec 5 ml de 1x PBS et mettez-la en suspension dans 5 ml de milieu cellulaire NK92MI.
6. Comptez les cellules SK-HEP-1 marquées à la calcéine AM et les cellules NK92MI à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
7. Remettre en suspension les cellules SK-HEP-1 dans le milieu de culture à raison de 1 x 10⁵ cellules/mL et les cellules NK92MI à raison de 1 x 10⁶ cellules/mL dans le milieu de cellules NK.
8. Cellules SK-HEP-1 marquées à la calcéine sur plaque (cellules cibles) (1 x 10⁴/100 μL/puits) avec cellules NK92MI (cellules effectrices) (1 x 10⁵/100 μL/puits) (rapport cible/effecteur de 1:10) par puits dans des puits triples dans une plaque de 96 puits.
9. Incuber les plaques à 96 puits à 37 °C dans une atmosphère composée à 95 % d’air et à 5 % de CO₂ pendant 4 h. Après l’incubation, capturez des images de fluorescence des cellules marquées à la calcéine AM à l’aide d’un microscope à fluorescence à un grossissement de 10x. Capturez au moins 10 champs différents de chaque répétition pour chaque condition de traitement.
10. Sélectionnez au hasard 10 images pour chaque réplique et comptez les cellules cibles marquées positives à la calcéine AM incubées avec ou sans cellules NK92MI. Calculez le % de cytotoxicité à l’aide de la formule ci-dessous.
    

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Colorant Calcein AM	Sigma-Aldrich	Référence 17783
DMEM	Gibco	Référence 11965-092
Sérum fœtal bovin	Gibco	26140079
Sérum de cheval	Gibco	16050114
Cellules NK92MI	ATCC	CRL-2408
Tampon phosphate salin (PBS)	Sigma-Aldrich	Réf. P4417
Cellules SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Solution de trypsine EDTA	Gibco	25200056