Mesure de la migration naturelle des cellules tueuses en réponse à des stimuli chimiotactiques

Résumé

Source : Chava, S., et al. Mesure de la cytotoxicité et de la migration médiées par les cellules tueuses naturelles dans le contexte des cellules tumorales hépatiques. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une méthode pour étudier la migration des cellules tueuses naturelles (NK) à travers un système d’insertion de membrane poreuse en réponse à des chimioattractants. Cette méthode permet une analyse quantitative de la migration des cellules NK à l’aide de la cytométrie en flux.

Protocole

1. Essai de migration des cellules NK

1. Cultivez des cellules NK92MI et des cellules de centrifugation à 160 x g pendant 3 min dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL.
2. Lavez la pastille cellulaire deux fois avec 5 ml de 1x PBS et remettez les cellules en suspension dans 3 ml de milieu cellulaire NK92MI sans sérum. Comptez les cellules NK92MI à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
3. Plaquez les cellules NK92MI (2,5 x 10 5 cellules/100 μL/puits) dans le compartiment supérieur de la chambre perméable au transpuits (insert de 6,5 mm de diamètre et pores de 5 μm).
4. Dans la chambre inférieure, ajoutez 0,6 mL de milieu sans sérum contenant du matériel à tester pour les propriétés chimioattractantes des cellules NK (par exemple, milieu conditionné, chimiokines, cytokines).
   note: Lors de la préparation d’un milieu conditionné, utiliser un milieu sérique réduit sans sérum ajouté pour éliminer l’interférence des protéines sériques dans l’essai de migration.
5. Incuber les 24 chambres bien perméables à 37°C pendant 4 h. Après 4 h, prélevez les cellules NK92MI non adhérentes et migrées de la chambre inférieure et transférez-les dans des tubes de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour une analyse plus approfondie.
   note: Le temps de culture peut varier en fonction du type de cellules cibles, ainsi que de la quantité et de la cinétique des chimiokines produites par les cellules cibles. Par conséquent, ce temps doit être déterminé empiriquement pour chaque type de cellule, chimiokine et expérience.
6. Ajouter un nombre prédéterminé de billes de comptage pour la cytométrie en flux dans un volume de 50 μL à chaque tube contenant des cellules NK migrées. Évaluez le volume d’une suspension cellulaire de 300 μL/puits à l’aide d’un cytomètre en flux capable de compter les cellules automatisé basé sur FACS.
   note: Mélangez soigneusement les billes de comptage pour la cytométrie en flux chaque fois avant utilisation pour vous assurer qu’un nombre constant de billes est utilisé afin de minimiser la variabilité expérimentale. Le pipetage inverse est recommandé avec des billes de comptage pour maintenir la précision. Utilisez uniquement des cellules NK et des billes de comptage pour la cytométrie en flux comme contrôles d’analyse FACS. Les auteurs recommandent de lire au moins 10 000 billes + cellules NK combinées, une quantité qui a bien fonctionné. Cependant, ce nombre peut varier en fonction des conditions expérimentales. Par conséquent, le nombre combiné de billes + cellules NK doit être déterminé empiriquement pour chaque type d’expérience. De plus, il est important d’effectuer des expériences à l’aide de triplets biologiques pour obtenir des résultats statistiquement significatifs et tenir compte de la variabilité entre les différents nombres de cellules.
7. Calculez le nombre absolu de cellules NK92MI migrées à l’aide de cette formule :
   

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles de comptage absolu	Thermo Fisher Scientific	Réf. C36950
Cellules NK92MI	ATCC	CRL-2408
Cellules SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Chambres perméables Transwell	Costar	Référence 3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Tampon phosphate salin (PBS)	Sigma-Aldrich	Réf. P4417
Alpha-MEM	Sigma-Aldrich	Référence M4256