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1. Préparer le complément et cibler les bactéries
- Préparer le complément de bébé lapin (BRC)
REMARQUE : Les critères détaillés pour la sélection des lots de complément se trouvent ici : https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Obtenez du BRC congelé et décongelez-le à l’eau froide courante. Mélangez physiquement le BRC toutes les ~10-20 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé. Ne soumettez pas le BRC à des cycles répétés de gel-dégel.
- Pendant la décongélation du CRB, étiquetez les tubes à centrifuger de 1,5 ml, 5 ml ou 15 ml. Placez les tubes étiquetés sur de la glace pour pré-refroidir. Aliquote du volume approprié BRC dans les tubes à centrifuger prérefroidis (après le remplissage, remettez immédiatement chaque tube dans la glace). Conservez les aliquotes à ≤ -70 °C au congélateur.
note: Environ 1 mL de complément est nécessaire pour chaque plaque d’essai. Les aliquotes complémentaires sont à usage unique et doivent être aliquotes dans des volumes adaptés aux schémas d’essai.
- Pour préparer un BRC inactivé par la chaleur, décongelez une aliquote de BRC actif. Préparez un bain-marie à 56 °C. Une fois le BRC complètement décongelé, transférez-le dans le bain-marie et incubez pendant 30 min.
- Après l’incubation, retirer le BRC inactivé à la chaleur du bain-marie et le laisser refroidir à température ambiante (RT) pendant 10 à 15 min. Mélanger vigoureusement et aliquote ~150 μL à 1,5 mL de tubes de microcentrifugation. Stocker les aliquotes à ≤ -10 °C.
- Préparer le stock de bactéries cibles
REMARQUE : La procédure ci-dessous est utilisée pour préparer 48 aliquotes de stock de bactéries cibles ; Si davantage d’aliquotes sont nécessaires, le protocole peut être mis à l’échelle.
- Sortez le flacon de bouillon principal de bactéries du congélateur et raclez la surface bactérienne congelée pour retirer une petite quantité de glace du flacon sur une plaque de gélose au sang. Remettez immédiatement le flacon de stock principal dans le congélateur.
- Étalez cette petite aliquote de bouillon bactérien sur la plaque de gélose au sang et couvrez-la avec le couvercle de la plaque. Incuber la plaque à l’envers pendant une nuit dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO2.
- Transférez ~10 colonies lisses isolées dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de bouillon LB. Incuber pendant 3 à 5 h à 37 °C en secouant doucement jusqu’à ce que le bouillon de culture ait une DO600 de ~0,6-0,7.
- Récoltez les 12,5 premiers ml de la culture et transférez-les dans un tube frais de 50 ml. Centrifuger la culture à 15 000 x g pendant 2 min à l’aide d’une micro-centrifugeuse de table. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL de glycérol-LB stérile à 15 %.
- Bien mélanger et distribuer des aliquotes de 0,5 mL dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL (~48 tubes). Conservez les aliquotes à ≤ -70 °C au congélateur.
- Confirmez l’identité bactérienne à l’aide du test d’agglutination avant utilisation.
- Détermination du facteur de dilution optimal pour les bactéries cibles
REMARQUE : Chaque lot de stock de bactéries cibles doit être titré dans des conditions de dosage pour déterminer la dilution nécessaire pour produire ~120 UFC/point sur des plaques LB.
- Prenez une plaque de microtitration (plaque de dilution) et ajoutez 135 μL de tampon de dosage dans le puits 1A. Ajoutez 120 μL de beurre de dosage dans les puits 1B-1H.
- Sortez un flacon de bactéries cibles congelées du congélateur et décongelez-le à température ambiante. Ajoutez 15 ul de bouillon bactérien décongelé dans le puits 1A pour faire une dilution 10 fois du stock bactérien.
- Transférez 30 μL de solution bactérienne du puits 1A au puits 1B pour effectuer une dilution en série de 5 fois. Continuer les dilutions en série de 5 fois jusqu’au puits 1H pour un total de 8 dilutions (1:10 ; 1:50 ; 1:250 ; 1:1 250 ; 1:6 250 ; 1 : 31 250 ; 1 : 156 250 ; 1:781 250).
- Procurez-vous une autre plaque de microtitration (plaque d’essai) et ajoutez 20 μL de tampon d’essai à tous les puits des colonnes 1 et 2 de la plaque d’essai.
- Transférez 10 μL de bactéries diluées de chaque puits de la colonne 1 de la plaque de dilution dans les puits correspondants des colonnes 1 et 2 de la plaque de dosage. 10 μL de bactéries sont transférés du puits 1A de la plaque de dilution dans les puits 1A et 2A de la plaque de dosage, etc.
- Poursuivez l’essai comme décrit dans le test bactéricide sérique (SBA) ci-dessous pour le témoin A et le témoin B, étapes 3.6 à 3.12.
- Une fois que les plaques ont été incubées sur de la glace, utilisez une pipette multicanaux avec 8 pointes de pipette pour repérer 10 μL des puits de la colonne 1 sur une plaque LBA. Repérez également les puits de la colonne 2 sur la plaque LBA.
- Poursuivez l’analyse comme décrit ci-dessous aux étapes 3.14 à 4.6.
- Déterminer la dilution bactérienne qui donne ~120 UFC/point dans le témoin B, cette dilution sera utilisée dans l’essai.
2. Dosage bactéricide sérique (SBA)
REMARQUE : La procédure décrite ci-dessous concerne une seule plaque de dosage, mais le nombre de plaques de dosage peut être augmenté.
- Inactivation thermique des échantillons d’essai par incubation dans un bain
note: Les échantillons d’essai doivent être inactivés par la chaleur avant l’essai afin d’abroger toute activité endogène du complément. Cela peut être fait avant le test et les échantillons inactivés peuvent être recongelés ou stockés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient testés.
- Procurez-vous une plaque de dosage et ajoutez 20 μL de tampon de dosage aux colonnes 1 à 12 des rangées A à G. Ajoutez 20 μL de tampon de dosage aux colonnes 1 et 2 de la ligne H, voir le tableau 1.
- Chargez 30 μL de chaque échantillon d’essai, en deux exemplaires, dans la rangée H de la plaque d’essai. Par exemple, distribuez 30 μL de l’échantillon 1 dans les puits 3H et 4H, et distribuez 30 μL de l’échantillon 2 dans les puits 5H et 6H, etc.
- Effectuez des dilutions en série 3 fois des échantillons de test à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Prélever 10 μ de l’échantillon des puits 3H-12H et les transférer dans les puits correspondants de la rangée G et bien mélanger l’échantillon en pipetant de haut en bas 8 à 10 fois.
- Ensuite, prélever 10 μ des puits 3G-12G et transférer dans les puits correspondants de la rangée F et bien mélanger.
- Continuez ces dilutions en série dans la rangée A. Après avoir mélangé les puits de la rangée A, retirez et jetez 10 μl des puits 3A-12A de sorte que tous les puits contiennent 20 μl.
note: Étant donné que 20 μL de sérum sont utilisés dans un volume total de dosage de 80 μL, il y a une dilution 4 fois supplémentaire dans le dosage. Cette dilution doit être prise en compte lors du calcul d’un titre de SBA en multipliant la dilution du sérum par 4. Par exemple, si une dilution initiale de 1:2 est utilisée, la dilution réelle testée est de 1:8.
- Retirer un flacon de bouillon de bactéries cibles congelé et décongeler à température ambiante. Diluer les bactéries dans 20 mL de tampon d’essai selon le facteur de dilution optimal prédéterminé (ce facteur de dilution a été déterminé à la section 1.3). Ajouter 10 μL de bactéries diluées dans chaque puits de la plaque de dosage à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Retirez un flacon de BRC congelé et un flacon de BRC congelé inactivé par la chaleur, décongelez à température ambiante avec de l’eau froide courante ou placez-le sur la grille d’une enceinte de sécurité biologique avec de l’air soufflé pour décongeler rapidement.
- Préparez une solution à 20 % de BRC inactivé par la chaleur. Mélangez 100 μL de BRC inactivé par la chaleur avec 400 μL de tampon de dosage. Ajouter 50 μL de cette solution de CRB inactivée à 20 % par la chaleur à tous les puits de la colonne 1 (puits de contrôle A).
note: Le BRC inactivé par la chaleur est utilisé comme contrôle pour surveiller la destruction non spécifique (NSK) dans l’essai.
- Préparez une solution à 20 % de BRC natif. Mélangez 1 mL de BRC natif avec 4 mL de tampon de dosage. Ajouter 50 μL de ce mélange dans tous les puits des colonnes 2 à 12 (puits de contrôle B et puits d’échantillon d’essai).
note: La concentration finale de BRC dans le mélange réactionnel est de 12,5 %.
- Mélangez brièvement la plaque de dosage en agitant doucement pendant 10 à 15 s sur un agitateur à plaques ou mélangez en pipetant de haut en bas 8 fois à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Placez la plaque de dosage dans un incubateur microbiologique à 37 °C pendant 2 h (sans agiter).
- Séchez 2 plaques LBA en retirant les couvercles et en plaçant les plaques face vers le haut dans l’enceinte de sécurité biologique pendant 40 à 60 min.
- Lorsque l’incubation de 2 h est terminée, déplacez la plaque d’essai sur de la glace humide et incubez pendant 10 à 20 minutes pour arrêter la réaction.
- À l’aide d’une pipette à 12 canaux, mélangez les puits de la rangée H et placez une plaque de 10 μL du mélange réactionnel au fond d’une plaque LBA. Inclinez immédiatement la plaque et laissez les spots courir sur ~1,5-2 cm. Répétez cette procédure pour les rangées G, F et E, en les repérant au-dessus de la rangée précédente sur la plaque LBA. Les rangées E, F, G et H sont tachetées sur une plaque LBA et les rangées A, B, C et D sont tachetées sur une deuxième plaque LBA de la même manière, voir la figure 1.
- Incuber les plaques LBA à température ambiante jusqu’à ce que la solution soit adsorbée dans les plaques LBA (10-15 min). Placez les couvercles sur les plaques LBA et placez les plaques LBA dans l’incubateur microbiologique à l’envers pour incuber pendant la nuit (~16-18 h). Incuber Shigella flexneri 2a et 3a à 29 °C et incuber S. sonnei à 26 °C.
note: Ces températures produisent des « micro-colonies » plus petites dont la taille convient à un comptage précis par un compteur de colonies9.
- Après une nuit d’incubation, ajouter 25 mL de gélose de recouvrement (à ~55 °C) contenant 100 μg/mL de TTC et 0,1 % de NaN3 dans chaque boîte de LBA.
- Incuber les plaques LBA à 37 °C pendant 2 h pour permettre aux bactéries survivantes de développer une couleur rouge, voir la figure 1 ci-dessous.
- Photographiez des plaques à l'aide d'un appareil photo numérique et transférez les images vers un ordinateur où le logiciel NICE (Integrated Colony Enumerating Software) du NIST a été installé, voir Figure 2.
note: Le logiciel de comptage des colonies NICE est disponible gratuitement. Voir la liste des matériaux pour plus de détails et les instructions d’installation.
Tableau 1 : Disposition des plaques de dosage. Les colonnes 1 et 2 contiennent les puits de contrôle du complément. Le témoin A se trouve dans la colonne 1 et est le témoin du complément inactivé par la chaleur, contenant le tampon SBA, les bactéries et le complément inactivé par la chaleur. Le témoin B se trouve dans la colonne 2 et est le témoin actif du complément, contenant le tampon SBA, les bactéries et le complément. Les colonnes 3 à 12 contiennent des échantillons de sérum. Chaque échantillon est analysé en double et dilué en série 3 fois de la rangée H à la rangée A
| 1 | deux | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| un | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 | Dilution 8 |
| L | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 | Dilution 7 |
| L | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 | Dilution 6 |
| D | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 | Dilution 5 |
| L | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 | Dilution 4 |
| L | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 | Dilution 3 |
| L | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 | Dilution 2 |
| H | Contrôle A | Contrôle B | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 | Dilution 1 |
| | | Echantillon 1 | Echantillon 2 | Echantillon 3 | Echantillon 4 | Echantillon 5 |
