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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des thymocytes apoptotiques marqués au CFSE
- Euthanasier deux souris C57/B6 naïves par inhalation de CO2 pendant 10 minutes et disséquer pour ouvrir la cavité thoracique, retirer (retirer) le thymus à l’aide d’une pince à pointe fine incurvée dans une boîte de Pétri de culture tissulaire contenant 10 ml de milieu de RPMI1640.
- Obtenez une suspension unicellulaire en broyant l’ensemble du thymus contre deux extrémités givrées des lames de microscope, puis filtrez la suspension à travers une crépine cellulaire de 100 μm.
- Prélever la suspension de thymus de 10 mL dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant, le remettre en suspension dans 40 mL de 1x PBS et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et retirez le surnageant.
- Remettre en suspension dans 20 mL de 1 x PBS dans un tube de 50 mL sous forme de suspension à cellule unique avec jusqu’à 2 x 108 cellules (s’il y a plus de 2 x 108 cellules, remettre le reste des cellules en suspension dans un autre 20 mL de 1 x PBS dans un autre tube de 50 mL).
- Préparez 5 μM de CFSE dans un volume égal (20 mL) de 1x PBS dans un tube séparé de 50 mL en pipetant 40 μL de solution mère CFSE (2,5 mM) dans 20 mL de 1x PBS et mélangez bien en inversant le tube 2 à 3 fois.
- Ajouter les 20 mL de CFSE de l’étape 1.7 dans les 20 mL de suspension cellulaire de l’étape 1.6 (la concentration finale de CFSE est maintenant de 2,5 μM).
note: Pour chaque suspension cellulaire de 20 ml, un tube CFSE de 20 ml est nécessaire.
- Retournez la cellule et le tube de mélange CFSE 2 à 3 fois et incubez le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant un maximum de 2 min, puis arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur.
- Centrifuger le mélange en tube de 50 mL à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
note: Si le marquage CFSE réussit, la pastille de cellule deviendra jaune clair.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 40 mL de 1x PBS et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Lavez à nouveau la pastille cellulaire avec 40 ml de RPMI1640 milieu.
- Retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec RPMI1640 milieu de culture tissulaire (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10 % de FBS (inactivé par la chaleur), 20 mM de glutamine et 1x Pen/Strep) à une concentration de 7 x 106 cellules/mL dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm.
note: Si plus de cellules sont obtenues, une boîte de culture tissulaire séparée de 100 mm sera nécessaire.
- Ajouter la staurosporine dans la suspension cellulaire, la culture à une concentration finale de 1 μM et la culture pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire alimenté à 5 % de CO2.
2. Préparation des macrophages péritonéaux
- Injectez par voie intrapéritonéale 1 mL de thioglycolate âgé à 3 % de chez deux souris C57B6 (ou toute souris manipulée en laboratoire) par voie intrapéritonéale.
- Euthanasiez les souris le jour 5 comme à l’étape 1.1, coupez et épluchez la peau abdominale mais laissez le péritoine intact. Rincer la cavité péritonéale en enfonçant rapidement 10 ml de tampon de lavage (RPMI1640, 2 % FBS, 0,04 % EDTA) dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 ml attachée à une aiguille de 18 g.
- Récupérez lentement le tampon de lavage avec la même aiguille ou seringue et recueillez le tampon de lavage dans un tube de 50 ml.
- Laver le gavage péritonéal deux fois avec 1x PBS, remettre en suspension les macrophages péritonéaux dans RPMI1640 milieu de culture tissulaire à une densité de 2 x 106 cellules/mL et aliquote 500 μL dans chaque puits de la plaque à 24 puits. Laissez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2 h.
- Retirez les cellules flottantes en les aspirant et en les remplaçant par 500 μL de milieu de culture frais, deux fois.
- De façon facultative, ajouter l’inhibiteur de tyrosine du récepteur TAM, RXDX-106, aux concentrations indiquées dans les légendes des figures dans chaque puits de la culture de macrophages et incuber pendant 2 heures supplémentaires.
3. Co-culture de macrophages péritonéaux avec des thymocytes apoptotiques
- Prélevez les thymocytes apoptotiques à partir de l’étape 1 et lavez-les trois fois avec RPMI1640 milieu. L’efficacité de l’induction apoptotique peut être mesurée à ce stade avec le kit Annexin V/7-AAD.
- Répartir 0 à 12 x 10cellules 6 (dans un milieu de 500 μL) dans chaque puits des cultures de macrophages du protocole #2, selon l’arrangement expérimental (par exemple, voir Figure 1). Cela fait le volume total de culture de 1 mL dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ajouter l’anticorps bloquant dans la culture immédiatement avant l’ajout de thymocytes apoptotiques.
- Cultivez le mélange cellulaire à 37 °C pendant 4 h dans un incubateur de culture tissulaire alimenté à 5 % de CO2.
- Lavez deux fois chaque puits de la culture avec 1x PBS (contenant 500 μM EDTA) pour éliminer les cellules apoptotiques flottantes.
- Colorer les macrophages liés à la plaque avec CD11b-PE à ce stade.
- Lavez une fois les macrophages liés à la plaque avec un tampon de coloration (1x PBS, 1 % BSA).
- Ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE dans chaque puits.
- Incuber la plaque à 4 °C pendant 20 min.
- Lavez chaque puits de la plaque trois fois avec le tampon de coloration.
- Ajouter 200 μL de tampon de coloration et procéder avec la plaque pour l’analyse d’images au microscope fluorescent.
