Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Collection de sérum
- Prélever des échantillons de sérum chez l’homme à des moments d’intérêt. Pour cette étude, nous avons recueilli des sérums aux jours 0 (moment de la vaccination antigrippale), +7, +30, +60 et +180 après la vaccination.
- Pour obtenir le sérum, centrifugez les tubes d’échantillon à 1 200 x g pendant 10 min à température ambiante (20 - 25 °C).
note: Les échantillons de sang non centrifugés doivent être conservés à 4 °C et pendant une durée maximale de 24 h.
- Aliquote le sérum dans différents tubes (cryo-flacons) et congélation à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Effectuez les tests suivants par lots, y compris tous les points temporels d’une personne pour réduire la variabilité au sein d’un patient.
2. Préparation des antigènes
ATTENTION : Cinq antigènes différents sont utilisés (voir Tableau des matériaux). Préparer les antigènes dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
- Selon les instructions du fabricant, reconstituer le contenu total d'une ampoule d'antigène grippal lyophilisé avec 1,0 mL d'eau distillée et laisser reposer l'antigène dissous pendant au moins 5 minutes à température ambiante avant de continuer.
- Aliquote la solution d’antigène dans des tubes de 1,5 mL et congeler à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.
3. Préparation du filtrat de choléra
NOTE : Le filtrat de choléra est utilisé comme enzyme destructrice de récepteurs (RDE) selon le protocole de l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Cela élimine les inhibiteurs innés du sérum qui interféreraient avec le dosage.
- Reconstituer le RDE lyophilisé selon les instructions du fabricant.
- Conservez la solution RDE dans un tube de 15 mL à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
4. Dosage HA
REMARQUE : Pour s’assurer que les dosages d’inhibition de l’hémagglutination (IH) sont comparables entre plusieurs plaques, la même quantité de particules virales doit être utilisée pour chaque plaque. Le dosage de l’hémagglutination (HA) (également appelé titrage HA) est effectué pour quantifier les particules virales nécessaires à l’hémagglutination et est enregistré dans les unités HA. Une « unité » d’hémagglutination est une unité opérationnelle dépendant de la méthode utilisée pour le titrage de l’AH et n’est pas une mesure d’une quantité absolue de virus. Ainsi, une unité d’AH est définie comme la quantité de virus nécessaire pour agglutiner un volume égal d’une suspension de GR standardisée. Selon l’OMS, la quantité standard utilisée pour le dosage HI est de 4 unités HA par 25 μL. Pour une illustration du principe du test HA, voir la figure 1.
REMARQUE : Les globules rouges (GR) utilisés dépendent du type de virus de la grippe testé (Tableau 1). De plus, pour divers types de plaques de microtitration à 96 puits, le temps d’incubation ainsi que l’apparence des cellules non agglutinées diffèrent (tableau 2).
- Préparation de la suspension de RBC
- Diluer la suspension stockée de globules rouges (10 %, v/v ; sauf le type humain O) (voir le tableau des matières) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir les concentrations appropriées pour les globules rouges aviaires et mammifères de 0,75 % et 1 %, respectivement.
- Préparation de la plaque de microtitration à 96 puits
REMARQUE : Voir la figure 2 pour une vue d’ensemble de la conception de la plaque.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 25 μL de PBS dans les puits 1 à 12 de chaque rangée utilisée d’une plaque de microtitration à 96 puits (figure 2). Utilisez la plaque de microtitration en forme de V lorsque vous travaillez avec des globules rouges aviaires, comme le poulet et la dinde. Utilisez la plaque de microtitration en forme de U lorsque vous travaillez avec des globules rouges de mammifères, comme les cobayes et les humains de type O (tableau 2).
- Ajouter 25 μL d’antigène grippal dans le premier puits des rangées d’antigènes, qui sont disposés en doublets. Aucun antigène n’est ajouté aux rangées de contrôle. Les rangées de témoins ne doivent pas présenter d’effet d’hémagglutination et servir de témoins négatifs (figure 2).
- Effectuer une dilution en série de 2 fois en transférant 25 μL du premier puits des rangées d’antigènes vers des puits successifs à l’aide d’une pipette multicanaux. Mélangez chaque étape de dilution en pipetant doucement de haut en bas 10 fois.
- Jetez les derniers 25 μL des derniers puits.
- Ajouter 25 μL de PBS dans les puits 1 à 12 de chaque rangée utilisée à l’aide d’une pipette multicanaux, pour atteindre un volume total de 50 μL par puits.
- Ajoutez 50 μL de suspension de globules rouges à chaque puits utilisé à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Tapotez soigneusement l’assiette 10 fois sur les quatre côtés pour mélanger.
- Couvrir l’assiette avec un couvercle et incuber à température ambiante pendant la durée appropriée selon l’espèce de globule rouge utilisée (voir le tableau 2). Ne déplacez pas la plaque pendant l’incubation.
- Lire la planche
REMARQUE : La lecture est légèrement différente selon les GR aviaires par rapport aux GR de mammifères, en raison de la forme différente des puits de microtitration (figure 3).
- Lecture des globules rouges aviaires
- Incliner la plaque à 90° pour 25 s.
note: Le critère d’évaluation du titrage de l’AH est le dernier puits où l’hémagglutination complète se produit. Ce puits contient 1 unité HA de virus. En raison des dilutions 2 fois plus importantes de l’antigène, deux puits en avant du critère d’évaluation de l’HA se trouve le puits qui contient 4 unités HA du virus (figure 4).
- Marquez les résultats immédiatement, alors que la plaque est toujours en position inclinée, sur un schéma imprimé de la plaque à 96 puits. Les modèles d’agglutination des globules rouges aviaires sont illustrés à la figure 3.
- Lecture des globules rouges de mammifères
- Marquez les résultats sur un schéma imprimé de la plaque à 96 puits, sans incliner la plaque (position horizontale sur le banc).
note: Lorsque l’hémagglutination se produit, les cellules agglutinées ne se déposent pas au fond, tandis que les cellules non agglutinées apparaissent comme un halo au fond du puits. Le halo des cellules partiellement agglutinées est moins intense et a un diamètre plus grand (Figure 3).
- Détermination des unités 4 HA.
note: L’inclinaison de la plaque est cruciale pour la différenciation des modèles aviaires, car les trois différents types de modèles d’agglutination (complètement agglutinés, partiellement agglutinés et non agglutinés) apparaissent comme un bouton lorsqu’ils ne sont pas inclinés.
5. Dosage HI
REMARQUE : Le flux de travail du protocole a été optimisé pour permettre une manipulation plus efficace de plusieurs échantillons en même temps, en utilisant des bandes de tubes de réaction en chaîne par polymérase (PCR) et un thermocycleur (voir ci-dessous).
- Préparation des échantillons de sérum
note: Préparer des échantillons de sérum dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
- Décongelez les échantillons de sérum congelés de chaque point temporel de chaque personne (voir étape 1.2) à température ambiante.
- Ajouter une aliquote de 10 μL de chaque échantillon de sérum décongelé dans un tube de bandelette de tube PCR (10 tubes dans une bandelette).
note: Le grand avantage de l’utilisation de bandelettes de tubes PCR est qu’une pipette multicanaux peut être utilisée pour les étapes suivantes du test HI ; Cela permet de gagner beaucoup de temps lors de l’analyse d’un grand nombre d’échantillons de sérum et lors de mesures répétées des mêmes échantillons pour les titres d’anticorps contre différentes souches virales.
- Conservez les échantillons de sérum aliquote dans les bandelettes de tube PCR à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
- Un jour avant la réalisation du test HI, décongelez les aliquotes de l’échantillon de sérum d’intérêt à température ambiante.
- Ajoutez 10 μL de l’antisérum approprié dans un tube PCR vide.
note: Pour servir de contrôle positif, l’antisérum contre un virus spécifique doit correspondre au virus utilisé. La commande positive permet de standardiser les performances des plaques sur plusieurs plaques.
- Ajouter 30 μL de solution de filtrat de choléra à chaque aliquote sérique et à l’antisérum (3 volumes de filtrat de choléra pour 1 volume de sérum) à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Conservez les tubes PCR dans un rack PCR à 96 puits ou dans une boîte à pointes vide et un vortex pendant 5 s.
- Incuber les échantillons pendant la nuit à 37 °C à l’aide d’un thermocycleur.
- Incuber les échantillons à 56 °C pendant 30 min pour inactiver le filtrat du choléra à l’aide d’un thermocycleur.
note: Selon le thermocycleur, cette étape peut être programmée pour automatiser davantage le processus.
- Conservez les tubes PCR dans un rack PCR à 96 puits ou dans une boîte à pointes vide et un vortex pendant 5 s.
- Conserver les échantillons à 4 °C au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour le dosage IH.
- HI assay
note: Pour une illustration du principe du test HI, voir la figure 1. Selon le virus, différentes espèces de globules rouges sont utilisées pour le test (tableau 1). Les différentes espèces de globules rouges sont utilisées dans divers types de plaques à 96 puits, et le temps d’incubation ainsi que l’apparence des cellules non agglutinées diffèrent (tableau 2). Pour le test IH, 4 unités HA de virus ou d’antigène sont ajoutées à la série de dilution 2 fois des échantillons.
- Préparation de la solution d’antigène
- Calculer le volume de solution d’antigène nécessaire en fonction du nombre de plaques à 96 puits utilisées (25 μL d’antigène par puits × 96 = 2 400 μL d’antigène par plaque à 96 puits ; ajouter 100 μL par plaque supplémentaire en raison de l’utilisation d’un réservoir pour la pipette multicanaux ; un total de 2,5 ml d’antigène par plaque).
note: Par exemple, si l’on mesure 100 échantillons de sérum, 10 plaques sont nécessaires (10 échantillons par plaque) : 2,5 mL x 10 = 25 mL de solution d’antigène nécessaire au total.
- Préparez la dilution correcte de 4 unités HA pour le volume calculé à l’aide de PBS.
REMARQUE : 4 unités HA sont déterminées pour le dosage HA. Pour obtenir la quantité appropriée d’antigène, divisez le volume calculé par le titre correspondant à 4 unités HA. Par exemple, 4 unités d’AH correspondent à une dilution de 1/64, et nous avions besoin de 15 000 μL de solution d’antigène : 15 000/64 = 234,4 μL d’antigène de grippe lyophilisé dissous sont ajoutés.
- Préparation de la suspension des globules rouges
- Calculez le volume de suspension de globules rouges nécessaire en fonction du nombre de plaques de microtitration à 96 puits utilisées (50 μL de suspension de globules rouges par puits × 96 = 4 800 μL de suspension de globules rouges par plaque de 96 puits ; ajoutez 200 μL supplémentaires par plaque en raison de l’utilisation d’un réservoir pour la pipette multicanaux).
- Diluer la suspension de globules rouges (normalement 10 %, v/v ; sauf le type humain O) avec du PBS pour obtenir les concentrations appropriées pour les globules rouges aviaires et mammifères de 0,75 % et 1 %, respectivement.
- Préparation de la plaque de microtitration à 96 puits
- Étiquetez les plaques de microtitration à 96 puits (ID de l’échantillon, contrôle positif et titrage arrière). Veuillez vérifier attentivement l’orientation de la plaque sur la figure 5.
- Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits sauf dans le premier puits de la rangée de « titrage arrière » (Figure 5, 12e rangée) à l’aide de la pipette multicanaux.
note: Un titrage inverse a été effectué pour vérifier si la dilution de l’antigène utilisée est égale à 4 unités HA. Un titre d’antigène de 4 unités HA est indiqué si l’hémagglutination se produit dans les trois premiers puits de la rangée de « titration arrière », mais pas dans le quatrième puits.
- Ajouter 50 μL de la solution d’antigène préparée (décrite à la section 5.2.1) dans le premier puits de la rangée de « titrage arrière » (12e rangée).
- Ajouter 25 μL d’échantillons de sérum traités par RDE dans les premiers puits des rangées 1 à 10 de chaque plaque, à l’aide de la pipette multicanaux.
- Ajouter 25 μL de l’antisérum approprié dans le premier puits de la 11e rangée comme témoin positif.
- Effectuez des dilutions en série de 2 en transférant 25 μL du premier puits de chaque rangée (1 - 12) vers des puits successifs à l’aide d’une pipette multicanaux. Mélanger en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois pour chaque étape de dilution. Les mêmes pointes peuvent être utilisées pour chaque étape de dilution par échantillon.
- Jetez les derniers 25 μL des derniers puits.
- Ajouter 25 μL de la solution d’antigène à l’aide d’une pipette multicanaux dans chaque puits des rangées 1 à 11 (échantillons de sérum et antisérum). Les mêmes pointes peuvent être utilisées si elles ne touchent pas les puits.
- Ajouter 25 μL de PBS au lieu de l’antigène dans chaque puits de la rangée de « titrage arrière » (12e rangée).
- Tapotez soigneusement l’assiette 10 fois sur les quatre côtés pour mélanger.
- Couvrez l’assiette avec un couvercle et laissez incuber à température ambiante pendant 30 min. Ne déplacez pas la plaque pendant l’incubation.
- Ajoutez 50 μL de suspension de globules rouges dans chaque puits.
- Tapotez soigneusement l’assiette 10 fois sur les 4 côtés pour mélanger.
- Couvrir l’assiette avec un couvercle et incuber à température ambiante pendant la durée appropriée selon l’espèce de globule rouge utilisée (voir le tableau 2). Ne déplacez pas la plaque pendant l’incubation.
- Lecture de la plaque
note: Le titre HI est l’inverse de la dernière dilution du sérum (anti-) qui inhibe complètement l’hémagglutination. Il est important de considérer que les sérums traités par RDE ont déjà été dilués 1:4 et qu’après l’étape de dilution en série, les sérums dans les premiers puits sont dilués 1:8, ce qui correspond à un titre HI de 8.
- Lecture des globules rouges aviaires
- Incliner la plaque de 90° pendant 25 s.
note: L’inclinaison de la plaque est cruciale pour la différenciation des modèles aviaires, car les trois différents types de modèles d’agglutination (complètement agglutinés, partiellement agglutinés et non agglutinés) apparaissent comme un bouton lorsqu’ils ne sont pas inclinés.
- Marquez les résultats immédiatement, alors que la plaque est toujours en position inclinée, sur un schéma imprimé de la plaque à 96 puits. Les modèles d’agglutination des globules rouges aviaires sont illustrés à la figure 3.
Tableau 1 : Antigènes de la grippe et espèces correspondantes de globules rouges. Selon les instructions du fabricant (NIBSC).
| Antigène de la grippe | A/Californie/7/09 (H1N1) | A/Suisse/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 |
| Espèces de globules rouges | poulet | cobaye | cobaye | Turquie | Turquie |
Tableau 2 : Conditions de dosage avec différentes espèces de globules rouges.Selon le protocole de l’OMS. (* s’écoule lorsqu’il est incliné).
| Espèces de globules rouges | poulet | Turquie | cobaye | Humain type O |
| Concentration de globules rouges (v/v) | 0,75 % | 0,75 % | 1 % | 1 % |
| Type de plaque de microtitration | Bas en V | Bas en V | Fond en U | Fond en U |
| Temps d’incubation, RT | Durée : 30 minutes | Durée : 30 minutes | 1 heure | 1 heure |
| Apparition de cellules non agglutinées | bouton* | bouton* | halo | halo |
