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1. Polarisation du HMDM
- Dans des conditions stériles, préparer le milieu d’amorçage M1 en ajoutant de l’interféron γ (IFNγ ; 20 ng/mL) et du lipopolysaccharide (LPS ; 1 μg/mL) au milieu de culture RPMI-1640 complet. Préparez le milieu d’amorçage M2 en ajoutant de l’interleukine 4 (IL-4 ; 20 ng/mL) au milieu de culture complet du RPMI-1640.
- Dans des conditions stériles, aspirer le milieu des puits de la plaque de culture tissulaire qui contiennent les macrophages dérivés des monocytes humains, HMDM, qui ont été ensemencés et cultivés comme décrit dans la section 1.
- Lavez soigneusement les puits contenant les cellules 3 fois avec du PBS stérile (préchauffé à 37 °C), en utilisant 1 mL d’aliquotes de PBS.
- Ajouter 1 mL du milieu d’amorçage M1 ou M2 dans chaque puits contenant le HMDM (selon ce qui convient à l’expérience).
- Incuber les cellules pendant 48 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
2. Stimulation de HMDM pour induire la libération de MET
- Dans des conditions stériles, préparer le milieu de culture contenant différents stimulateurs de la libération de MET par des pièges extracellulaires de macrophages (selon ce qui convient à l’expérience) dans le milieu complet du RPMI-1640 : PMA (25 nM), TNFα recombinant humain (25 ng/mL) ou IL-8 recombinant humain (50 ng/mL).
- Pour les expériences avec l’acide hypochloreux, la stimulation HOCl, préparer HOCl (200 μM) dans HBSS (préchauffé à 37 °C), immédiatement avant l’ajout aux cellules. Assurez-vous que le HOCl n’est pas préparé dans un milieu cellulaire complet.
note: La concentration de la solution mère de HOCl est quantifiée en mesurant l’absorbance UV de la solution à 292 nm et pH = 116 et en utilisant un coefficient d’extinction de 350 M-1 cm-1.
- Après le traitement de polarisation décrit à la rubrique 2, aspirer le milieu cellulaire de chaque puits et laver soigneusement les cellules 3x avec 1 mL d’aliquotes de : PBS stérile (pour PMA, TNFα et IL-8) ou HBSS (pour HOCl), qui ont été préchauffés à 37 °C.
- Pour les expériences avec du PMA, du TNFα ou de l’IL-8 : ajouter 1 mL du milieu complet contenant du PMA, du TNFα ou de l’IL-8 après avoir retiré le PBS lors de l’étape de lavage finale.
- Pour les expériences avec le TNFα, incuber les cellules pendant 6 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire. Pour les expériences avec le PMA et l’IL-8, incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
- Pour les expériences avec le HOCl, ajoutez 1 mL de HOCl dans le HBSS après avoir retiré le HBSS lors de l’étape finale du lavage. Ensuite, incubez les cellules pendant 15 min à 37 °C en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
- Aspirez soigneusement le surnageant cellulaire et lavez-les 3 fois avec des aliquotes de 1 mL de HBSS comme décrit à l’étape 2.3.
- Après avoir retiré le HBSS de l’étape finale de lavage, ajoutez 1 mL de milieu de culture RPMI-1640 complet. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2 dans un incubateur cellulaire.
3. Visualisation de MET en culture de cellules vivantes
- Préparer le colorant vert SYTOX dans HBSS à une concentration de 40 μM.
- À la fin des traitements décrits dans la section 2 pour induire la libération de MET, ajoutez directement 25 μL de 40 μM de colorant dans chaque puits contenant du HMDM.
- Incuber les cellules à température ambiante (RT) pendant 5 minutes dans l’obscurité.
- Placez le HMDM dans des puits de culture tissulaire sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée pour l’imagerie.
- Procédures au microscope
- Allumez une source de lumière fluorescente à large spectre, une source de lumière à fond clair et un microscope inversé installé avec un appareil photo numérique couleur haute résolution (voir la table des matériaux).
- Tournez la roue à filtres en position « numéro 2 » pour la fluorescence verte (excitation = 504 nm, émission = 523 nm) pour l’imagerie des échantillons colorés en vert contenus dans les puits de culture tissulaire.
- À l’aide de l’objectif 5x, faites la mise au point de l’image avec la mise au point grossière, puis les boutons de mise au point fine du microscope, jusqu’à ce que l’image apparaisse nette, claire et nette lorsqu’elle est vue à travers l’oculaire du microscope.
- Basculez le microscope en mode appareil photo.
- Démarrez le logiciel associé.
- Sélectionnez l’onglet Capture du logiciel.
- Cliquez sur le bouton Lecture pour prévisualiser l’image et régler le bouton de mise au point fine du microscope jusqu’à ce que l’image apparaisse nette, claire et nette dans la fenêtre d’aperçu du logiciel.
- Cliquez sur le bouton Capturer.
note: L’image capturée sera automatiquement affichée dans le logiciel d’accompagnement.
- Dans le logiciel, cliquez sur Fichier | Enregistrez en tant que type de fichier image requis.
- Sur le microscope, tournez la roue à filtres sur la position « numéro 5 » pour l’imagerie en fond clair et répétez les étapes 3.5.2 à 3.5.9 pour obtenir l’image en fond clair correspondante.
- Répétez les étapes 3.5.2 à 3.5.10 si nécessaire pour l’acquisition ultérieure de l’image.