Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Purification des leucocytes polymorphonucléaires humains et isolement du sérum humain
REMARQUE : Tous les réactifs doivent être régulièrement vérifiés pour détecter la présence d’endotoxines à l’aide d’un kit de détection d’endotoxines disponible dans le commerce et doivent contenir <25,0 pg/mL d’endotoxine pour éviter l’amorçage indésirable des PMN.
- Apporter 50 mL de NaCl à 3 % de dextrane à 0,9 % (p/v), 35 mL de NaCl à 0,9 % (p/v), 20 mL de NaCl à 1,8 % (p/v), 12 mL de solution à gradient de densité de 1,077 g/mL et 20 mL d’eau d’injection ou d’irrigation à température ambiante.
- Pour isoler le sérum humain, incuber 4 mL de sang humain fraîchement prélevé sans anticoagulant à 37 °C dans un tube de verre de 15 mL pendant 30 min. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon à 2 000 à 3 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Transférez la couche supérieure de sérum dans un tube à centrifuger conique frais de 15 ml et placez-la sur de la glace.
- Combinez 25 ml de sang humain total hépariné (1000 unités/ml) fraîchement prélevé avec 25 ml de NaCl à 3 % de dextran et 0,9 % de NaCl à température ambiante (rapport 1:1) dans deux tubes à centrifuger coniques de 50 ml (volume total de 50 ml par tube). Mélanger en balançant doucement chaque tube conique de 50 ml, puis laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes.
- Après l’incubation à température ambiante, deux couches distinctes apparaîtront. Transférez la couche supérieure de chaque mélange de dextran et de sang dans de nouveaux tubes coniques de 50 ml et centrifugez à 450 x g pendant 10 min à température ambiante avec des freins faibles ou nuls.
- Aspirez soigneusement les deux surnageants et jetez-les sans déranger les pastilles cellulaires. Remettez doucement en suspension chaque pastille de cellule dans 2 mL de NaCl 0,9 % à température ambiante, combinez les pastilles remises en suspension dans un seul tube conique de 50 mL, puis ajoutez le reste à 0,9 % de NaCl (volume final de 35 mL).
- Sous-couche soigneusement 10 ml de solution à gradient de densité de 1,077 g/mL à température ambiante sous la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette à main. Essorage à 450 x g pendant 30 min à température ambiante avec des freins faibles ou nuls. Aspirez doucement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Le surnageant contiendra des cellules mononucléées du sang périphérique qui peuvent être collectées comme décrit précédemment.
- Lysez les globules rouges en les remettant en suspension dans 20 ml d’eau à température ambiante. Mélangez doucement en balançant le tube pendant 30 secondes. La lyse des globules rouges s’accompagnera d’une nette diminution de la turbidité.
- Ajouter immédiatement 20 ml de NaCl à 1,8 % (à température ambiante [RT]) et centrifuger l’échantillon à 450 × g pendant 10 minutes à température ambiante.
note: Il est important de réduire au minimum le temps pendant lequel les NMP sont laissés dans l’eau seule après la lyse des globules rouges afin de maximiser le rendement des NMP et de prévenir la lyse et/ou l’activation des NMP.
- Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettez doucement la pastille en suspension dans 2 mL de milieu RT RPMI 1640 et placez-la sur de la glace.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Remettre en suspension les PMN purifiés à une concentration de 1 x 107 cellules/mL avec du RPMI glacé et les conserver sur de la glace.
- Combinez 100 μL de PMN purifiés (1 x 106 cellules) avec 300 μL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) glacée contenant 1 μL de colorant à l'iodure de propidium dans deux tubes de cytométrie en flux répliqués. Pour un contrôle positif des lésions de la membrane plasmique, ajouter 40 μL de solution de Triton X-100 à 0,5 % dans l’un des tubes de cytométrie en flux et bien mélanger.
- Utilisez la cytométrie en flux pour mesurer la diffusion vers l’avant, la diffusion latérale et la coloration à l’iodure de propidium (maxima d’excitation/émission à 535/617 nm) des cellules purifiées (Figure 1).
note: L’analyse de la diffusion vers l’avant et sur le côté permettra d’identifier les populations indésirables de lymphocytes et de monocytes. L’iodure de propidium ne colore que les cellules dont la membrane plasmique est compromise et les PMN purifiés qui ont des populations prononcées de cellules positives à l’iodure de propidium ne doivent pas être utilisés. Pour ces études, les PMN purifiés n’ont été utilisés que s’ils représentaient >98 % des cellules purifiées et <5 % étaient colorés positifs pour l’iodure de propidium.
- Préparez une plaque de 96 puits pour les tests de cytotoxicité du PMN en enduisant les puits individuels qui seront utilisés dans cet essai avec 100 μL de sérum humain isolé à 20 % qui a été dilué avec DPBS.
note: Le placage des PMN directement sur du plastique ou du verre provoquera l’activation des cellules. Assurez-vous d’inclure au moins un puits de contrôle négatif qui ne recevra que du média et au moins un puits de contrôle positif qui recevra 0,05 % de Triton X-100.
- Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min. Après l’incubation, lavez deux fois les puits enrobés avec du DPBS glacé pour éliminer tout excès de sérum. Tapotez doucement la plaque à l’envers pour enlever tout résidu de DPBS et placez-la sur de la glace.
- Ajouter délicatement 100 μL de PMN humains purifiés à raison de 1 x 107 cellules/mL dans chaque puits enrobé (1 x 106 PMNs/puits). Laissez les NMP se déposer dans les puits en incubant la plaque sur de la glace pendant au moins 5 min. Maintenez la plaque à niveau pour permettre une distribution uniforme des cellules dans chaque puits et laissez-la sur la glace pour éviter l’activation indésirable des PMN.
2. Essai de cytotoxicité des protéines extracellulaires de S. aureus contre les leucocytes polynucléaires humains
- Cultivez S. aureus pendant une nuit dans un bouillon de soja tryptique (BST) à l’aide d’un incubateur à agitation réglé à 37 °C. Dans le cadre de ces études, 20 mL de BST ont été inoculés dans des fioles erlenmeyer séparées de 150 mL avec des cultures congelées de souches USA300 ou USA300ΔsaeR/S de S. aureus et cultivés pendant environ 14 h en agitant à 250 tr/min.
- Sous-culture S. aureus en effectuant une dilution de 1:100 d’une culture bactérienne pendant la nuit avec un milieu frais. Incuber à 37 °C en secouant jusqu’à ce que les bactéries atteignent la phase de croissance stationnaire précoce.
note: Pour ces expériences, 20 mL de bouillon de soja tryptique dans des flacons Erlenmeyer de 150 mL ont été inoculés avec 200 μL desaeR/S USA300 ou USA300Δ cultivés pendant la nuit et incubés à 37 °C en agitant à 250 tr/min pendant 5 h.
- Lorsque les bactéries ont atteint la phase de croissance stationnaire précoce, transférez 1 mL de S. aureus sous-cultivé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez à 5 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Après la centrifugation, transvaser le surnageant dans une seringue de 3 mL. Faites passer les surnageants à travers un filtre de 0,22 μm et dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace.
- Effectuer des dilutions en série de surnageants avec des milieux glacés utilisés pour la culture de S. aureus.
note: Pour les expériences présentées, les surnageants de USA300 et USA300ΔsaeR/S ont subi quatre dilutions consécutives de 1/2 log avec du TSB glacé.
- À partir de l’étape 1.15, ajouter délicatement des échantillons de surnageant ou des milieux seuls (pour les témoins négatifs et positifs) à des puits individuels de plaques de 96 puits contenant des NMP sur de la glace. Pour ces expériences, 10 μL d’échantillons de surnageantsaeR/S USA300 ou USA300Δ ont été ajoutés à chaque puits. Basculez doucement la plaque pour répartir les surnageants dans les puits et incubez à 37 °C.
- Aux moments souhaités, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la sur de la glace. Ajouter 40 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans le puits de contrôle positif.
- Pipetez doucement les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN collés à la plaque, puis transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie à écoulement sur glace contenant 300 μL de DPBS glacés avec 1 μL d’iodure de propidium.
- Mesurer la proportion de NMP positives à l’iodure de propidium à l’aide de la cytométrie en flux (figure 2A). Lorsqu’il est lié à l’ADN, l’iodure de propidium a une excitation/émission à 535/617 nm.
