Dosage de la cytotoxicité des souches de Staphylococcus aureus sur les neutrophiles après phagocytose

Résumé

Source : Dankoff, J. G. et al., Quantification de la cytotoxicité de Staphylococcus aureus contre les leucocytes polymorphonucléaires humains. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons un test permettant de détecter la cytotoxicité de souches virulentes et moins virulentes de Staphylococcus aureus contre des neutrophiles humains après phagocytose à l’aide de la cytométrie en flux.

Protocole

1. Essai de cytotoxicité de S. aureus contre les leucocytes polymorphonucléaires humains après phagocytose

REMARQUE : Les courbes de croissance définies par la densité optique à 600 nm (OD600) et la concentration des bactéries doivent être déterminées empiriquement pour les souches de S. aureus à tester avant de commencer cet essai. Le succès de ces expériences nécessite la récolte constante de concentrations égales de chaque souche de S. aureus testée à la phase de croissance exponentielle moyenne en utilisant la DO 600 de bactéries sous-cultivées.

1. Commencer les cultures de nuit des souches de S. aureus et des bactéries de sous-culture comme décrit ci-dessous.
   1. Cultivez S. aureus pendant une nuit dans un bouillon de soja tryptique (BST) à l’aide d’un incubateur à agitation réglé à 37 °C. Dans le cadre de ces études, 20 mL de BST ont été inoculés dans des fioles Erlenmeyer séparées de 150 mL avec des cultures congelées des souches USA300 ou USA300ΔsaeR/S de S. aureus et cultivés pendant environ 14 h en agitant à 250 tr/min.
   2. Sous-culture S. aureus en effectuant une dilution de 1:100 d’une culture bactérienne pendant la nuit avec un milieu frais. Incuber à 37 °C en agitant.
2. Récoltez S. aureus sous-cultivé lorsqu’il a atteint une croissance exponentielle moyenne en transférant 1 mL de bactéries cultivées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et en centrifugeant à 5 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
   note: Dans nos conditions de croissance, USA300 et USA300ΔsaeR/S ont atteint la phase de croissance mi-exponentielle après environ 135 minutes d’incubation.
3. Laver S. aureus après la centrifugation en aspirant le surnageant, en remettant en suspension les bactéries granulées dans 1 mL de DPBS, en tourbillonnant l’échantillon pendant 30 s et en centrifugeant à 5 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
4. Opsoniser S. aureus en remettant en suspension la pastille bactérienne dans 1 mL de sérum humain à 20 % dilué avec du DPBS et en l’incubant à 37 °C avec agitation pendant 15 min.
5. La centrifugeuse a opsonisé les bactéries à 5 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Laver S. aureus après la centrifugation en aspirant le surnageant, en remettant en suspension les bactéries granulées dans 1 mL de DPBS, puis en faisant tourbillonner l’échantillon jusqu’à ce que la pastille bactérienne soit complètement brisée plus 30 secondes supplémentaires. Centrifuger les bactéries à 5 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
6. Remettre en suspension des souches de S. aureus opsonisées dans 1 mL d’IPPM, agiter l’échantillon jusqu’à ce que la pastille bactérienne soit complètement brisée, puis pendant 30 secondes supplémentaires. Placer les bactéries sur de la glace.
7. Diluer les souches opsonisées de S. aureus à la concentration souhaitée avec de l’IPPM glacé. Vortex pendant 30 s et placer sur la glace.
8. Confirmer la concentration de S. aureus opsonisé en enfonçant des dilutions en série de bactéries à 1:10 sur une gélose tryptique de soja.
   note: Étant donné que les différences dans la concentration des bactéries utilisées dans cet essai peuvent avoir un impact majeur sur la perméabilité ultérieure de la membrane plasmique PMN (figure 1A), il est essentiel que la concentration de chaque souche testée soit déterminée pour chaque expérience et qu’elle soit équivalente entre les souches.
9. Ajouter délicatement 100 μL/puits de chaque souche de S. aureus ou RPMI (pour les témoins positifs et négatifs) aux NMP dans la plaque de 96 puits sur glace. Rochez doucement la plaque pour répartir S. aureus dans les puits.
10. Synchroniser la phagocytose en centrifugant la plaque à 500 × g pendant 8 min à 4 °C. Incuber la plaque à 37 °C immédiatement après la centrifugation (T = 0).
11. Aux moments souhaités, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la sur de la glace. Ajouter 40 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans le puits de contrôle positif.
12. Pipetez doucement les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN collés à la plaque, puis transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie à flux sur de la glace contenant 200 μL de DPBS glacé avec 1 μL d’iodure de propidium.
13. Analyser les échantillons pour la coloration à l’iodure de propidium à l’aide de la cytométrie en flux.
14. Mesurer la proportion de PMN positives à l’iodure de propidium à l’aide de la cytométrie en flux. Lorsqu’il est lié à l’ADN, l’iodure de propidium a une excitation/émission à 535/617 nm.

Résultats

Figure 1 : Analyse par cytométrie en flux des PMN après phagocytose de S. aureus. (A) La proportion de PMN positives à l’iodure de propidium 90 min après la phagocytose de différentes concentrations de USA300 ou USA300∆saeR/S. (B) La concentration de souches de S. aureus opsonisées utilisées pour les expériences est indiquée dans le panneau A. Les don...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes micro-centrifugeurs de 1,5 mL avec Snap Caps	VWR	Référence 89000-044	Utilisé dans les cellules de lavage
12x75mm Tubes de culture	VWR	Référence 60818-430	Utilisé comme tubes de cytométrie en flux
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL	VWR	Référence 89039-656	Pour les fluides de distribution
Bouillon de soja Bacto tryptique, milieu de digestion soja-caséine	FischerScientific	211823	Pour la culture cellulaire
Hémocytomètre à lignes claires	Sigma-Aldrich	Z359629	Appareil de comptage de cellules
DPBS, 1x (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) avec calcium et magnésium	Corning	Référence 21-030-CV	Utilisé dans les cellules de lavage
Ficoll-Paque PLUS	GE Soins de santé	Référence 17-1440-02	Purification du PMN
Fisherbrand Pipettes sérologiques jetables stériles en polystyrène	FischerScientific	13-678-11F	Pour l’aspiration de liquide
Plaques à 96 puits Greiner CELLSTAR	Millipore Sigma	Référence M0687	Plaque pour la conservation d’échantillons expérimentaux
Filtres pour seringues OMICRON	Omicron Scientifique	SFPV13R	Pour filtrer les surnageants
Iodure de propidium	ThermoFisher Scientific	Réf. P3566	Coloration à l’ADN imperméable à la membrane
Marque PYREX 4980 Erlenmeyer Flacons	Cole-Parmer	EW-34503-24	Pour la culture cellulaire
RPMI 1640, 1X sans L-glutamine, rouge de phénol	Corning	17-105-CV	Utilisé dans les cellules de remise en suspension
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Contrôle positif de l’intégrité de la membrane