Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Souches et conditions de culture
Remarque : La souche CDC1551 de M. tuberculosis est utilisée dans cette étude, mais n’importe quelle souche de M. tuberculosis peut être utilisée de la même manière.
- Cultivez les bactéries dans un milieu M-OADC-TW (bouillon 7H9 complété par 0,5 % de glycérol, 10 % de complexe de dextrose d’acide oléique sans catalase et 0,05 % de Tween-80) à 37 °C jusqu’à une DO600 de 0,5 (~ 0,2 x 107 unité formant colonie ou UFC).
- Diluer la culture dans M-OADC-TW (série de dilutions 1:10 de la bactérie). Déposer les dilutions des bactéries (10,5, 10,6, 10,7, 10,8) en trois exemplaires sur des plaques sélectives 7H11 pour permettre la détermination de l’UFC.
- Incuber les plaques pendant quatre semaines à 37 °C ou jusqu’à ce que les colonies puissent être comptées avec précision.
- Centrifuger l’inoculum bactérien à 8 534 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille. Lavez la pastille une fois avec 10 mL de solution saline (0,9 % NaCl) et remettez la pastille en suspension dans 15 mL de solution saline (0,9 % NaCl).
2. Infection par aérosol de souris à l’aide d’une chambre de Madison
- Laissez les souris s’acclimater au nouvel environnement pendant une semaine.
- Pesez les souris avant de les charger dans la chambre.
- Branchez trois cordons dans la multiprise : l’alimentation de la chambre principale, la pompe à vide et le compresseur d’air, dans cet ordre.
- Dévissez soigneusement le bocal en verre. Apportez le bocal en verre dans l’enceinte de biosécurité et ajoutez l’inoculum de provocation en suspension dans 15 mL de solution saline (0,9 % NaCl) pour obtenir ~ 104 - 106 UFC de bactéries dans les poumons.
- Fermez le couvercle du bocal en verre dans l’enceinte de biosécurité. Fixez le bocal à l’unité de nébulisation et ajustez le tube vertical en acier inoxydable de sorte que l’extrémité inférieure (admission) soit à environ un quart de pouce en dessous du niveau du liquide dans le bocal.
- Chargez tous les animaux nécessaires à l’expérience (la chambre peut contenir jusqu’à 90 souris) dans la chambre et fermez tous les loquets de la porte.
- Vérifiez le débitmètre d’air principal (de la pièce). Assurez-vous que le centre du flotteur (bille) fonctionne à environ 50 L/min, tel que mesuré sur l’échelle à gauche.
- Appuyez sur le bouton Démarrer sur le panneau de commande de la chambre. Réglez le débit d’air à travers le débitmètre d’air du compresseur (le plus petit compteur à gauche) à 4 L/min sur la balance. Vérifiez visuellement que l’inoculum de provocation est en cours de nébulisation.
- Après 15 min, lorsque le voyant rouge à l’avant du panneau de commande apparaît et qu’un signal sonore indique la fin de la course, appuyez sur le bouton de réinitialisation situé dans le coin inférieur droit du panneau de commande pour réinitialiser les minuteries.
- Maintenez enfoncé le petit bouton rouge situé sur la porte de la chambre pour libérer le vide.
- Ouvrez la porte de la chambre et retirez les animaux. Remettez les souris dans leurs cages.
- Retirez le bocal de nébulisation en verre et placez-le dans un récipient de transport scellé et étanche. Placez le récipient à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique et jetez la suspension de défi dans un conteneur à déchets désigné.
- Placez le bocal de nébulisation usagé dans un sac à risque biologique et scellez-le pour le transport vers l’autoclave.
- À la fin de la procédure d’infection, vaporisez l’intérieur de la chambre avec du phénol tamponné et de l’éthanol à 70 % et laissez la chambre reposer pendant 10 min.
- Ensuite, essuyez très soigneusement toutes les surfaces intérieures accessibles. Jetez toutes les serviettes en papier contaminées, etc. dans la corbeille des risques biologiques. Autoclavez les ordures, les conteneurs à déchets et les bocaux de nébulisation usagés.
- Replacez les animaux dans la salle de confinement jusqu’au moment de l’imagerie.
- Le jour de l’imagerie, transférez les animaux dans un conteneur secondaire vers la salle d’imagerie.
3. Anesthésie animale
- Anesthésie les souris avec de l’isoflurane à l’aide d’un système d’anesthésie gazeuse personnalisé.
- Pesez chacune des deux cartouches de filtre à charbon situées sur le dessus de l’unité d’anesthésie.
- Remplacez-le par un bidon neuf si le poids est supérieur de 50 g au poids initial.
- Vérifiez l’unité du vaporisateur pour vous assurer qu’il y a suffisamment d’isoflurane pour la procédure.
- Placez le support du cône nasal à l’intérieur de la chambre d’imagerie. Placez le nombre de cônes nasaux requis pour la procédure et scellez les ouvertures restantes avec les bloqueurs de cônes nasaux.
- Allumez l’alimentation en oxygène de la bouteille haute pression et réglez-la à 55 psi.
- Allumez la pompe d’évacuation située à l’avant de l’unité d’anesthésie et réglez-la sur 8 L/min.
- Allumez la bascule d’oxygène située à l’avant de l’unité d’anesthésie.
- Activez le débit de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie pour régler le débit de gaz à 1,5 L/min. Désactivez le débit de gaz.
- Activez le débit de gaz vers la chambre d’imagerie pour régler le débit de gaz à 0,25 L/min. Désactivez le débit de gaz.
- Allumez le vaporisateur d’isoflurane et réglez-le sur 2 - 2,5 %. Ajustez le niveau d’isoflurane en fonction du nombre et du poids des animaux utilisés pour l’expérience en tournant le cadran du vaporisateur d’isoflurane (2 à 2,5 % pour une souris pesant ~20 g ; 4 % pour un cochon d’Inde pesant 300 g).
- Placez les souris dans la chambre d’anesthésie et fermez le couvercle. Allumez le flux de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie.
- Laissez les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement anesthésiées.
- Une fois les souris anesthésiées, appliquez une pommade optique sur les yeux pour les protéger pendant l’imagerie.
- Placez les souris en position ventrale ou sternale de sorte que leur nez soit placé dans le cône nasal pour faciliter l’anesthésie des souris pendant la procédure d’imagerie.
4. Imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure (REF)
- Injecter le substrat (20 μM, 2,5 μL/g de poids) par injection intrapéritonéale chez les souris infectées ainsi que chez les souris témoins. Les souris sont sous anesthésie à l’intérieur de la chambre d’imagerie pendant moins d’une minute.
- Démarrez le système d’imagerie.
- Initialisez le système en cliquant sur Initialiser. Attendez que la barre de température devienne verte.
note: La chambre d’imagerie se compose d’une plate-forme chauffée pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant l’imagerie.
- Pour le réglage de l’acquisition d’imagerie, sélectionnez Fluorescent | Trans-illumination pour l’animal entier ou Epi-illumination pour les tissus pulmonaires, structure et superposition dans le panneau de contrôle d’acquisition.
- Réglez le champ de vision sur B pour une seule souris et le niveau de la lampe sur élevé.
- Réglez le temps d’exposition sur auto, le binning moyen, 2 - 3 pour le f/stop, le filtre d’excitation à 745 nm et les filtres d’émission de 780 nm à 840 nm.
- Pour la configuration de la séquence, cliquez sur Configuration de la séquence et sélectionnez 9 à 12 points de trans-illumination dans la zone pulmonaire.
- Cliquez sur Acquérir pour l’acquisition de l’image.
- Remettez la souris dans la cage après l’imagerie.
- Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies ou sacrifiez-les pour quantifier l’UFC si l’imagerie est à un moment de l’expérience. Effectuer un score de Karnofsky modifié pour surveiller le bien-être des souris après l’imagerie.
