Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement et différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM)
- Jour 0 : Sacrifiez une souris C57BL/6 ou BALB/c femelle de 4 à 6 semaines dans une chambre de CO2 et confirmez la mort par luxation cervicale. Assurez la stérilisation des ciseaux et des pinces en les maintenant trempés dans de l’éthanol à 70 %. Gants de pulvérisation avec de l’éthanol à 70 % pour permettre une manipulation stérile tout au long du processus d’isolement des cellules de la moelle osseuse.
- Fixez la souris sacrifiée à la planche de dissection en épinglant ses membres antérieurs et en la désinfectant en la vaporisant copieusement d’éthanol à 70 %.
- Faites une petite incision (environ 1 cm) avec des ciseaux près de l’articulation de la hanche. Insérez soigneusement des ciseaux sous la peau pour séparer le muscle sous-jacent et coupez la peau autour de l’articulation de la hanche.
note: La planche de dissection peut être tournée pour permettre un meilleur accès à l’articulation de la hanche.
- Retirez soigneusement la peau de la jambe en tirant vers la cheville et en la retirant. Coupez le pied au niveau de la cheville, en faisant très attention de couper au niveau ou en dessous de l’articulation de la cheville pour laisser le tibia complètement intact.
note: À ce stade, le péroné est attaché de manière lâche et peut être facilement séparé avec la pince.
- Localisez manuellement l’articulation de la hanche en manipulant le fémur pour identifier le point de rotation. Utilisez soigneusement des ciseaux pour sectionner la jambe au-dessus de l’articulation de la hanche afin de laisser la tête proximale du fémur intacte.
- Retirez autant de muscle et de tissu conjonctif que possible de la jambe avec des ciseaux. Retirez toute peau restante de la cheville et tout excès de matériau osseux au-dessus de l’articulation de la hanche.
- Placez les os de la jambe nettoyés dans une boîte de Pétri sur glace stérile du Roswell Park Memorial Institute, complétée par de la pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %).
- Répétez les étapes 1.4 à 1.6 pour isoler le tibia et le fémur de l’autre patte arrière.
- Retirez tout muscle et tissu conjonctif restant des os trempés dans le RPMI à l’aide d’une pince stérilisée et d’une lame stérile #10.
- Placez les os sur le couvercle de la boîte de Pétri. Coupez soigneusement le tibia avec la lame immédiatement au-dessus de l’articulation de la cheville pour accéder à la moelle. Retirez le tibia du reste de la jambe en coupant immédiatement sous l’articulation du genou.
- Prélever 10 mL d’IPRP stérile complété par de la pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) dans une seringue de 10 mL et y fixer une aiguille de 25 G.
- Tenez fermement le tibia à l’aide d’une pince, verticalement au-dessus d’un tube conique de 50 ml sur de la glace. À l’aide de la seringue, injectez doucement environ 5 ml d’IPPM dans l’extrémité de l’os afin d’évacuer la moelle osseuse de l’autre extrémité dans le tube conique. Rincer la moelle osseuse avec un total de 10 mL d’IPPM jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
note: Après un rinçage complet, l’os devrait devenir blanc. Sinon, continuez à rincer pour enlever la moelle. L’extrémité distale du tibia peut devoir être coupée avec la lame si elle est trop étroite pour insérer l’aiguille.
- Coupez le fémur immédiatement au-dessus de l’articulation du genou et immédiatement en dessous de l’articulation de la hanche pour exposer les deux extrémités de l’os afin d’accéder à la moelle. Rincer la moelle osseuse du fémur avec un total de 10 mL d’IPPM de la même manière que le tibia.
- Répétez les étapes de nettoyage et de rinçage 1.6 à 1.13 avec les os restants et recueillez les cellules rincées de la moelle osseuse dans un seul tube conique de 50 mL
note: Si un os se brise à n’importe quel moment pendant la dissection avant le rinçage osseux, n’utilisez pas la moelle de cet os.
- Centrifuger le tube conique utilisé pour prélever la moelle osseuse dans les quatre os pendant 10 min à 4 °C à 300 x g.
- Placer 60 mL de milieu BMM stérile (IPBR avec une concentration finale de 20 % de sérum de bovin fœtal, FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1,2 mM de Na-pyruvate, 25 μg/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (M-CSF) dans une fiole deculture cellulaire de 175 cm avec capuchon filtrant.
- Jeter le surnageant après la centrifugation et remettre en suspension la pastille cellulaire par pipetage doux de haut en bas à l’aide de 5 mL de milieu BMM de la fiole.
- Transférez la suspension cellulaire dans le ballon de culture et rincez deux fois le tube conique avec le milieu BMM du ballon de culture pour assurer une récupération cellulaire maximale. S’assurer que la suspension cellulaire est bien mélangée dans un milieu et répartir 30 mL du premier ballon deculture cellulaire de 2 cm de 175 cm dans un deuxième ballon de culture cellulairede 2 cm de 175 cm muni d’un capuchon filtrant.
- Incuber les deux flacons contenant une suspension cellulaire de 30 ml chacun pendant la nuit à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO2) pour permettre la séparation des fibroblastes contaminants, des macrophages résidents et des autres cellules adhérentes.
- JOUR 1 : Transférer le surnageant contenant des cellules indifférenciées de moelle osseuse à partir de flacons dans des boîtes de Pétri en polystyrène de 100 mm x 15 mm non traitées au TC à environ 10 mL/boîte et incuber à 37 °C, 5 % de CO2.Jetez les flacons.
- JOUR 3 ou 4 : Ajouter 5 ml de milieu BMM supplémentaire (préchauffé à 37 °C) dans chaque boîte de Pétri et poursuivre l’incubation à 37 °C, 5 % CO2.
2. Placage des BMM sur des lamelles pour l’infection (JOUR 7 ou 8)
- Préparez des plaques de culture tissulaire à 6 puits en plaçant quatre (4) lamelles en verre stériles de 12 mm (autoclavées et stockées dans un récipient en verre fermé) au fond de chaque puits vide.
note: Prélever chaque lamelle stérile de 12 mm à l’aide d’une pointe d’aspiration montée sur une conduite de vide. Placez les lamelles dans les puits sans chevauchement, en les libérant à la position souhaitée en pinçant le tube pour interrompre le vide.
- Aspirez les milieux (et toutes les cellules non adhérentes) des boîtes de Pétri recouvertes de macrophages adhérents dérivés de la moelle osseuse et rincez doucement les cellules adhérentes 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco stérile sans chlorure de calcium et de magnésium (PBS -/-) préchauffée à 37 °C.
- Ajouter goutte à goutte 5 mL stérile de 1x PBS -/- avec une concentration finale de 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans chaque boîte de Pétri et incuber pendant 5 min à 37 °C pour détacher les BMM adhérents. Vérifier que les cellules sont détachées à l’aide d’un microscope.
- Prélever toutes les cellules détachées en suspension dans 1x PBS -/- complété par 1 mM d’EDTA dans un tube conique de 50 mL. Rincer chaque plat 2 fois avec 5 mL de PBS -/- et l’ajouter à la réserve de suspension cellulaire.
note: La suspension cellulaire peut être diluée avec du PBS supplémentaire -/- pour protéger les macrophages de la toxicité de l’EDTA pendant le processus de collecte.
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les macrophages dans un milieu BMM de 5 à 10 mL par pipetage. Placez les cellules remises en suspension sur de la glace pour éviter qu’elles ne se fixent aux tubes et ne s’agglutinent.
- Compter les cellules viables à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan dans l’hémocytomètre.
note: Pour compter les cellules BMM remises en suspension dans un milieu de 5 mL, un mélange de dilution de 25 μL de suspension cellulaire dans 445 μL de PBS -/- et de 30 μL de solution de bleu de trypan à 0,4 % permet généralement une quantification facile dans un hémocytomètre (en tenant compte d’un facteur de dilution de 20x pour le calcul final). Ne comptez que les cellules qui n’ont pas été colorées au bleu de trypan (cellules viables). Le volume de la suspension cellulaire peut être modifié si ce mélange est trop concentré ou dilué. En général, le rendement en BMM par préparation varie entre 2 x 107 et 5 x 107 cellules d’une seule souris.
- Préparez la suspension cellulaire dans un milieu BMM à la concentration de placage souhaitée (5 x 105/mL) et dispersez la suspension dans des plaques à 6 puits dans un milieu de 2 mL par puits de sorte que chaque puits reçoive 1 x 106 macrophages.
note: Il s’agit d’une étape essentielle qui garantit que chaque puits reçoit un nombre adéquat de macrophages pour couvrir uniformément les lamelles. Vérifiez que les lamelles dans les puits ne se chevauchent pas ou ne flottent pas dans le fluide. Si c’est le cas, ajustez doucement à l’aide d’une pointe de pipette stérile.
- Incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % CO2.
3. Purification des formes infectieuses de Leishmania amazonensis
REMARQUE : Préparez Leishmania pour les infections - purifiez les promastigotes métacycliques à partir de cultures de promastigotes stationnaires, ou différenciez les promastigotes en culture en forme d’amastigote en utilisant le protocole standard de différenciation axénique de L. amazonensis.
- Purification de promastigotes métacycliques de Leishmania à l’aide de milieux à gradient de densité (Matériaux)
- Préparez une solution mère à 40 % de milieux à gradient de densité dans de l’eau stérile sans endotoxines.
- Diluer la solution de gradient de densité dans 10x milieu M199 (sans sérum) pour préparer une concentration de 10 % dans le milieu M199.
- Filtrez toutes les solutions à travers un filtre de 0,22 μm.
note: Les solutions mères peuvent être conservées à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 mois au maximum.
- Ajouter 2 mL de solution de média à gradient de densité de 40 % dans le fond d’un tube à centrifuger conique de 15 mL.
- Déposer soigneusement une couche de 2 mL de solution de milieu à gradient de densité de 10 % dans M199 par-dessus la couche de milieu à gradient de densité de 40 %, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter tout mélange entre les deux couches.
- Prélever 1 x 109 parasites d’une culture en phase stationnaire par centrifugation à 1 900 x g pendant 10 min.
- Remettre les cellules en suspension dans 6 mL de milieu essentiel modifié (DMEM) de Dulbecco.
- Déposer 2 mL de suspension cellulaire directement sur la couche de milieu à gradient de densité de 10 %, doucement, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter de mélanger les couches.
- Centrifuger le gradient pendant 10 min à 1 300 x g à température ambiante.
note: En raison des différences de propriétés physiques entre les espèces de Leishmania, les conditions de centrifugation de chacune d’entre elles peuvent devoir être légèrement ajustées pour assurer un rendement maximal.
- Prélever les parasites (enrichis sous forme de promastigote métacyclique) à partir de la bande formée à la limite supérieure du milieu du gradient de densité de 10 % (interface entre les couches de milieu du gradient de densité de 0 % et de 10 %).
- Diluer les parasites avec un volume de DMEM et recueillir par centrifugation (1 900 x g pendant 10 min à température ambiante).
- Remettre en suspension dans un milieu DMEM de 500 μL et compter dans un hémocytomètre pour quantifier le rendement.
- Génération d’amastigotes de L. amazonensis dans des conditions d’élevage axéniques (pH bas / température élevée)
- Mélanger 5 mL de culture de promastigote en phase logarithmique (pH 7,4 à 26 °C) avec un volume égal de milieu amastigote (pH 4,5), à l’aide de25 cm de 2 flacons (milieu total de 10 ml), et incuber à 26 °C pendant la nuit.
- Déplacez la fiole de 26 °C à 32 °C.
- Après 3 ou 4 jours, culture fractionnée 1:5 dans un milieu amastigote à 32 °C.
- Vérifiez les parasites dans les 3 à 4 prochains jours (maximum 7 jours) pour voir s’ils sont prêts à être utilisés dans les infections.
note: Les amastigotes axéniques sains doivent avoir une forme ovale, sans flagelles visibles. Les amastigotes partiellement différenciés ont une grande forme ovale avec des flagelles courts. La culture ne doit pas avoir beaucoup de touffes - de nombreuses touffes sont une indication de parasites non en croissance et mourants. La culture de l’amastigote peut être divisée à l’échelle 1:5 et maintenue pendant un maximum de 3 semaines.
4. Infection par L. amazonensis
- Diluer les suspensions parasitaires en fonction de la multiplicité d’infection souhaitée (MOI) (généralement 3 à 5 promastigotes métacycliques par macrophage [MOI de 1:3 ou 1:5] et 1 amastigote par macrophage [MOI 1:1]). Ajouter Leishmania dans du PBS -/- dans un volume de 50 à 100 μL dans chaque puits contenant déjà 2 mL de milieu.
- Incuber des BMM pendant 1 h avec des amastigotes et 3 h avec des promastigotes métacycliques à 34 °C pour une infection.
note: La température optimale de l’infection peut varier selon l’espèce.
- Après l’incubation, éliminer soigneusement les parasites libres dans chaque puits 3 fois avec 2 mL de PBS -/- préchauffé à 37 °C.
note: Dispersez doucement le PBS pour vous assurer que les lamelles ne flottent pas les unes sur les autres. Agitez doucement l’assiette, puis aspirez le liquide. Utilisez un embout d’aspiration séparé si vous utilisez plusieurs souches de parasites pour éviter la contamination croisée.
- Fixez des échantillons ponctuels de 1 h ou 3 h en incubant chaque puits avec 1,5 à 2 mL de PFA à 2 % dans du PBS -/- pendant 10 min. Laver 3 fois avec du PBS -/-. Ne pas aspirer les plaques de lavage et de réfrigération contenant des lamelles dans du PBS jusqu’à ce qu’elles soient tachées.
- Ajouter 2 ml de milieu BMM frais dans chaque puits sur des plaques pour plus de points de temps et incuber à 34 °C.
- Fixez les points de temps restants comme vous le souhaitez, comme décrit à l’étape 4.3, et réfrigérez les plaques jusqu’à ce qu’elles colorent.
5. Coloration du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Montage et montage de la lamelle
- Aspirez le PBS des puits contenant des lamelles et ajoutez 1,5 mL de PBS -/- avec 0,1 % de détergent non ionique. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de 3 lavages avec 2 mL de PBS -/-.
- Ajouter 1 mL de PBS -/- avec 2 μg/mL de DAPI (dilué à partir de 5 mg/mL de solution mère dans l’eau) dans des puits contenant des lamelles et incuber pendant 1 h supplémentaire à température ambiante.
note: Le temps d’incubation avec le DAPI est critique pour une bonne visualisation des parasites intracellulaires de Leishmania. Les noyaux des macrophages se colorent rapidement, en raison de leur plus grande taille et de leur teneur en acide désoxyribonucléique (ADN), mais la coloration des noyaux des parasites intracellulaires est plus lente. Ainsi, il est nécessaire d’allonger le temps d’incubation au-delà de ce qui est nécessaire pour visualiser les noyaux BMM afin de permettre au DAPI de pénétrer à travers la membrane plasmique du parasite et la membrane nucléaire du parasite. Avec une coloration DAPI appropriée, l’ADN du kinétoplaste mitochondrial près de la poche flagellaire du parasite peut également être visualisé, en plus de l’ADN nucléaire.
- Lavez chaque puits contenant des lamelles 3x avec 2 mL de PBS -/-, puis soulevez et retournez les lamelles avec une pince pour placer le côté cellulaire vers le bas et fixez-les sur des lames de microscope en verre avec un réactif de montage anti-décoloration disponible dans le commerce.
note: Les lamelles sont extrêmement fragiles et nécessitent une manipulation prudente. Évitez d’exercer une pression sur eux, en particulier contre la paroi latérale des puits lors du levage. L’ajout de quelques gouttes de PBS -/- réduit la tension superficielle entre la lamelle de recouvrement et le puits et facilite le processus de levage. Une aiguille fine peut être utilisée pour aider à soulever les lamelles du fond du puits. Après avoir placé une lamelle sur la glissière, appuyez doucement avec une pince pour expulser les bulles d’air dans le support de montage. Si une lamelle est cassée ou s’est peut-être retournée pendant le processus de levage, ne remontez pas ; Il suffit d’utiliser la quatrième lamelle de rechange.
- Réfrigérer les lames jusqu’à quantification.
6. Quantification de l’infection
- Examinez des lames colorées au DAPI au microscope à fluorescence en faisant la mise au point sur les macrophages à l’aide d’une lentille d’objectif 100X avec de l’huile d’immersion (excitation à 358 nm ; émission optimale à 461 nm).
Assurez-vous que l’accent est mis sur la couche de macrophages entre la lame de verre et la lamelle.
- Quantifier le nombre de macrophages (gros noyaux colorés au DAPI) et le nombre de petits noyaux d’amastigote regroupés autour de chaque noyau de macrophage (voir Figure 1A, DAPI) pour chaque champ de vision, à l’aide d’un compteur manuel><.
note: Les noyaux d’amastigote peuvent ne pas être tous visibles dans un seul plan de foyer en raison de leur petite taille. Comptez ceux qui sont visibles lorsqu’ils sont focalisés sur les noyaux de macrophages, puis utilisez la mise au point fine pour vérifier la présence de noyaux de parasites dans les plans au-dessus et en dessous des noyaux de macrophages.
- Déplacez-vous vers un autre champ de vision pour répéter la quantification. Utilisez une touche de compteur distincte pour suivre le nombre de champs comptés. Déplacez-vous dans les champs visuels en rangées parallèles sur chaque lamelle, afin d’éviter le chevauchement des comptages.
- Quantifier un minimum de 200 macrophages par lamelle. Quantifier chaque point temporel de l’infection en trois exemplaires (3 lamelles). Comptez la quatrième lamelle si l’une des précédentes ne convient pas au comptage en raison d’un chevauchement de lamelle, d’un mauvais montage, d’un bris de verre, etc.
note: Si 200 macrophages ne peuvent pas être comptés sur une seule lamelle, comptez le quatrième de rechange.
- Calculez les taux d’infection en amastigotes/macrophages ou amastigotes/100 macrophages et déterminez le pourcentage de macrophages infectés à partir des données de quantification brutes.
