1. Passage des cultures organoïdes
- Ajouter 1 ml de milieu de base froid dans la matrice du socle dans le puits. À l’aide d’une micropipette de 1 ml, pipeter vigoureusement de haut en bas jusqu’à ce que la matrice sous-jacente soit brisée. Transférer dans un tube de 15 ml. Placer sur de la glace.
- Prenez des organoïdes dans la pipette et pipetez vigoureusement 10x de haut en bas. La rupture des organoïdes peut être observée à l’œil nu.
2. Microinjection de culture organoïde.
Remarque : Ce protocole peut être utilisé pour micro-injecter des bactéries dans des organoïdes. Il peut être utile de commencer l’injection avec des organoïdes plus permissifs à la micro-injection. Par exemple, les organoïdes gastriques de souris peuvent se transformer en très gros organoïdes kystiques faciles à cibler.
- Préparation du matériel
- Tirez un capillaire en verre dans deux aiguilles d'injection à l'aide d'un extracteur de micropipette, selon les recommandations du fabricant. L’extracteur de micropipette chauffera le capillaire en verre au milieu et tirera le capillaire en deux parties, générant ainsi deux aiguilles de verre. Il est pratique de tirer plusieurs aiguilles et de les ranger dans une boîte de Pétri propre.
- Pour permettre une infection bactérienne, retirez les antibiotiques de tous les milieux pendant au moins 3 changements de milieu (= une semaine). Cela diluera les antibiotiques de la matrice basale. Si vous utilisez une souche bactérienne résistante à un antibiotique spécifique, ajoutez cet antibiotique spécifique pour minimiser les risques de contamination.
- Préparez l’établi pour les micro-injections. Pour les travaux à différents niveaux de biosécurité, il peut être nécessaire de placer un stéréomicroscope à l’intérieur d’une paillasse stérile. Dans ce protocole, on injecte H. pylori dans des conditions de biosécurité de niveau 2 sous un stéréomicroscope à l’intérieur d’une paillasse stérile.
- Cultivez les bactéries selon les protocoles standards.
- Pour estimer la multiplicité de l’infection (MOI), estimez deux paramètres : le nombre de bactéries et le nombre de cellules par organoïde, comme indiqué ci-dessous. Le MOI peut être corrélé avec les résultats, par exemple avec l'expression de l'ARNm IL-8 de l'hôte.
- Pour calculer la densité bactérienne dans la solution d’infection, établissez d’abord la courbe standard de la densité optique et des unités formant colonies (UFC) selon les protocoles standard. Une densité optique de 0,1 à 550 nm devrait donner environ 107 UFC/ml.
- Pour estimer le nombre de cellules par organoïde, comptez le nombre d’organoïdes dans 1 puits. Perturber les organoïdes comme indiqué aux étapes 1.1 à 1.4. Après une centrifugation de 5 min à 200 x g et 4 °C, ajouter 1 ml de solution de dissociation enzymatique et remettre en suspension.
- Incuber à 37 °C avec des agitations répétées pendant 5 à 10 min. Déterminer si les cellules se sont dissociées en cellules uniques au microscope (microscope inversé tel que Leica DMIL à un grossissement de 10X). Si nécessaire, prolongez l’incubation.
- Comptez les cellules par organoïde à l’aide d’un hémocytomètre et calculez le nombre de cellules par organoïde. Les organoïdes gastriques humains d’un diamètre d’environ 200 μm ont environ 4 000 cellules. L’injection de 0,2 μl d’une solution bactérienne avec 1 x 109 bactéries par ml donne un moment d’inertie approximatif de 50.
- Injection d’organoïdes.
Remarque : Pour la microinjection, l’aiguille en verre est stabilisée dans un support, qui peut être manœuvré en 3 dimensions par un micromanipulateur. Les organoïdes restent à l’intérieur de la matrice du socle du puits. En raison de leur taille et de leur positionnement dans le puits, tous les organoïdes ne se prêtent pas également à l’injection. Habituellement, les 30 plus grands organoïdes d’un puits peuvent être ciblés en 5 minutes.
- Récoltez les bactéries et lavez-les dans le milieu basal selon les protocoles standard.
- Calculez le nombre de bactéries par ml en fonction de la densité optique (voir étape 2.1.5.1). Diluer les bactéries à 1 x 109 bactéries par ml dans un milieu basal.
- Prenez une aiguille de verre. À l’aide d’une pince, cassez la pointe de manière à ce que l’ouverture ait une largeur d’environ 10 m.
- Insérez l’aiguille dans le porte-injection et fixez-la au micromanipulateur.
- Prélever environ 10 μl de solution bactérienne dans l’aiguille.
- Placez une plaque à 4 puits avec des bords bas contenant des cultures d’organoïdes sous le stéréomicroscope.
- En naviguant avec le micromanipulateur, ciblez un seul organoïde avec l’aiguille. Positionnez l’aiguille près de l’organoïde, puis insérez l’aiguille dans l’organoïde d’un mouvement rapide. Injectez environ 0,2 μl de solution bactérienne dans chaque organoïde à l’aide du micro-injecteur.
3. Récoltez des organoïdes pour toute analyse.
- Par exemple, fixez les organoïdes après 4 heures. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml de formaldéhyde à 2 % et incubez 20 min à RT ou O/N à 4 °C. Les organoïdes peuvent être traités pour l’immunohistochimie selon les procédures standard.