Évaluation de la croissance intracellulaire des mutants de Coxiella dans les cellules eucaryotes

Résumé

Source : Martinez, E. et al., Génération et criblage multiphénotypique à haut contenu des mutants transposons de Coxiella burnetii.J. Vis. Exp.(2015)

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation de la croissance intracellulaire de mutants de Coxiella marqués à la GFP dans des cellules épithéliales en culture. Le phénotype mutant est visualisé à l’aide de l’immunocoloration et de la microscopie à épifluorescence, ce qui permet d’étudier l’effet de la mutation sur la croissance intracellulaire.

Protocole

1. Génération d’une bibliothèque de protéines de fluorescence vertes, mutants de Coxiella transposon marqués à la GFP

Manipulez Coxiella burnetii RSA439 NMII dans un confinement de biosécurité de niveau 2 (BSL-2) dans une enceinte de sécurité microbienne (MSC) conformément aux règles locales. Si compatible avec le modèle bactérien utilisé, répéter les étapes de 1.4.1 à 1.4.4 pour augmenter la probabilité d’obtenir des mutants clonaux. Une banque de mutants typique est composée (au moins) d’un nombre de mutants égal à trois fois le nombre de séquences codantes annotées dans le génome de l’organisme utilisé.

1. Préparation de Coxiella RSA439 NMII électrocompétente :
   1. Préparez 1 citrate cystéine acidifié medium-2 (ACCM-2) : 13,4 mM d’acide citrique, 16,1 mM de citrate de sodium, 3,67 mM de phosphate de potassium, 1 mM de chlorure de magnésium, 0,02 mM de chlorure de calcium, 0,01 mM de sulfate de fer, 125,4 mM de chlorure de sodium, 1,5 mM de L-cystéine, 0,1 g/L de Bacto Neopeptone, 2,5 g/L d’acides casaminés, 1 g/L de méthylbêta-cyclodextrine, 125 ml/L de Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Ajustez le pH à 4,75 et filtrez la stérilisation (ne pas autoclave).
      note: L’ACCM-2 liquide est stable à 4 °C pendant environ 1 mois.
   2. Inoculer 100 ml d’ACCM-2 avec 2 x 10⁶ équivalents génomiques (EG)/ml de Coxiella RSA439 NMII (à partir d’un stock bactérien préalablement généré et quantifié comme à l’étape 1.5) à partir de stocks à -80 °C et répartir la suspension bactérienne dans des flacons de^{culture cellulaire de 75} cm à capuchon ventilé (10 à 15 ml de suspension bactérienne par ballon). Cultiver pendant 7 jours à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) et 2,5 % d’oxygène (O₂).
   3. Regrouper la suspension bactérienne obtenue dans des tubes de 50 ml et centrifuger à 3 900 x g pendant 1 heure à 4 °C.
   4. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 30 ml de glycérol à 10 %. Centrifugeuse à 3 900 x g pendant 1 h à 4 °C.
   5. Remettre la pastille en suspension dans un volume adéquat de 10 % de glycérol (généralement 2 ml) et d’aliquote 50 μl dans des tubes de 500 μl. Gardez les bactéries en suspension sur la glace pendant tout le processus.
      note: À ce stade, les bactéries sont électrocompétentes et une aliquote suffit pour effectuer une électroporation. Les suspensions bactériennes peuvent être stockées à -80 °C pendant 6 mois ou être utilisées directement pour l’électroporation de l’acide plasmidique désoxyribonucléique (ADN).
2. Électroporation de Coxiella compétents avec des plasmides codant pour des transposons et des transposases :
   1. Pré-refroidir une cuvette d’électroporation de 0,1 cm pendant 10 min sur de la glace. Mélangez 50 μl de Coxiella électrocompétent avec 10 μg de plasmide transposon et 10 μg de plasmide transposase. S’assurer que la concentration du plasmide est supérieure à 500 μg/ml pour minimiser la dilution du glycérol.
   2. Électroporat à l’aide de la configuration suivante : 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Assurez-vous que la constante de temps résultante est comprise entre 9 et 13 ms.
   3. Ajouter immédiatement 950 μl de RPMI, remettre en suspension les bactéries électroporées et les transférer dans un tube à bouchon à vis et conserver à température ambiante.
   4. Prélever 200 μl de bactéries électroporées et ajouter 3 ml d’ACCM-2 complété par 1 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) dans des plaques à 6 puits. Ajouter 88 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO) au volume restant de bactéries électroporées (pour atteindre une concentration finale de 10 % de DMSO) et stocker à -80 °C.
      REMARQUE : pour le protocole suivant, l’élément transposable et la transposase sont codés par deux plasmides différents (pITR-CAT-GFP et pUC19-Himar1C9, respectivement). Les deux plasmides n’ont pas d’origine de réplication spécifique à Coxiella, ce qui en fait des plasmides suicides lorsqu’ils sont électroporés dans Coxiella. Cela garantit des insertions de transposons stables. L’élément transposable contient une cassette de résistance au chloramphénicol sous la régulation du promoteur Coxiella p1169 pour la sélection et le gène gfp sous la régulation du promoteur Coxiella p311 pour marquer les mutants générés avec GFP.
3. Sélection des mutants transposons :
   1. Incuber les plaques à 6 puits inoculées comme décrit ci-dessus (1.2.4) pendant une nuit à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ et 2,5 % d’O2. Ajouter les antibiotiques appropriés (375 μg/ml de kanamycine ou 3 μg/ml de chloramphénicol). Incuber la culture bactérienne pendant 3 jours supplémentaires dans les conditions décrites ci-dessus.
4. Isolement de mutants individuels :
   1. Préparation de plaques solides ACCM-2 et placage de mutants de transposon Coxiella
      note: Les instructions suivantes sont pour 1 boîte de Pétri, plusieurs dilutions de cultures bactériennes doivent être testées pour évaluer le volume d’inoculation optimal pour l’isolement de la colonie.
      1. Faites chauffer 10,5 ml d’agarose à 0,5 % au micro-ondes et laissez-le refroidir au bain-marie à 55 °C. Chauffer 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) à 37 °C.
      2. Préparer l’agarose de fond :
         1. Mélanger 10 ml d’agarose fondue à 0,5 % avec 10 ml de 2x ACCM-2 et ajouter les antibiotiques appropriés (375 μg/ml de kanamycine ou 3 μg/ml de chloramphénicol).
         2. Versez immédiatement dans la boîte de Pétri. Gardez la boîte de Pétri ouverte, laissez refroidir pendant 30 min et sécher à l’air libre pendant 20 min.
      3. Préparez l’agarose supérieure :
         1. Mélangez 1,25 ml de 2x ACCM-2 avec 0,75 ml d’eau dans un tube en polystyrène de 5 ml, ajoutez les antibiotiques appropriés (375 μg/ml de kanamycine ou 3 μg/ml de chloramphénicol) et incubez à 37 °C.
         2. Ajouter la culture bactérienne (généralement de 1 à 100 μl) et agiter pendant 5 secondes.
         3. Ajouter 0,5 ml d’agarose fondue, mélanger et verser immédiatement sur l’agarose du bas.
         4. Laisser refroidir pendant 20 min, replacer le couvercle sur la boîte de Pétri et incuber à 4 °C pendant 20 min pour faciliter la solidification de l’agarose.
         5. Sécher à l’air libre pendant 20 min sans couvercle dans un MSC. Plaques de culture à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ et 2,5 % O₂ pendant 6 à 7 jours.
   2. Ajouter du DMSO aux cultures bactériennes restantes afin d’atteindre une concentration finale de 10 % de DMSO et conserver à -80 °C.
   3. Évaluer la dilution optimale comme suit : s’assurer que les colonies ont un diamètre de 0,5 à 1 mm et qu’elles sont correctement isolées pour éviter la contamination croisée. Décongeler les cultures bactériennes restantes du point 1.4.2 et les mettre sur plaque à la dilution appropriée sur gélose ACCM-2, comme décrit aux points 1.4.1.2 et 1.4.1.3. Incuber pendant 6 à 7 jours comme décrit à l’alinéa 1.4.1.3.5.
   4. Une fois que les colonies sont détectables, prélevez-les en coupant l’extrémité d’un embout de 1 ml, en prélevant le bouchon contenant les colonies isolées et en dispersant la colonie en pipetant 1,5 ml d’ACCM-2 contenant les antibiotiques appropriés (375 μg/ml de kanamycine ou 3 μg/ml de chloramphénicol) dans une plaque de 24 puits. Amplifier les colonies individuelles pendant 6 jours dans les conditions décrites au point 1.3.1. Au 3e jour de l’incubation, dispersez les amas bactériens en pipetant chaque culture.
   5. Stockez chaque suspension mutante dans des tubes à bouchon à vis à code-barres 2D dans des plaques de 96 puits dans 10 % de DMSO à -80 °C.
5. Évaluation de la concentration bactérienne :
   note: Le protocole suivant peut être appliqué pour obtenir les courbes de croissance de mutants bactériens se répliquant dans un milieu axénique (voir 1.4.4).
   1. Préparation de la courbe standard :
      1. Préparer une solution mère de 2 μg/ml d’ADN double brin (ADNdb) (généralement un plasmide aléatoire de taille et de concentration connues) dans de l’acide tris-éthylènediaminetétraacétique 1x, EDTA (TE). Préparer des dilutions en série de 10 fois à partir de la solution mère pour obtenir des concentrations allant de 2 μg/ml à 2 ng/ml. Distribuer 50 μl de chaque concentration dans des puits simples d’une microplaque de 96 puits à parois et fond noirs (voir le tableau des Matériaux).
      2. Diluez le réactif de quantification de l’ADNdb 1:200 dans 1 tampon TE et ajoutez 55 μl du réactif dilué à chaque échantillon dans la microplaque à 96 puits. Bien mélanger à l’aide d’un agitateur et incuber 2 à 5 min à température ambiante, dans l’obscurité.
      3. Mesurez la fluorescence des échantillons à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence et de filtres pour les longueurs d'onde de fluorescéine standard (excitation ~480 nm, émission ~520 nm).
      4. Tracez la plage de concentration plasmidique en fonction des lectures d’intensité de fluorescence.
   2. Quantification de la suspension bactérienne :
      1. Distribuer 5 μl de Triton X-100 à 10 % par puits dans une microplaque de 96 puits avec des parois et un fond noirs (voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 μl de suspensions bactériennes dans chaque puits et incuber pendant 10 min à température ambiante, sur une plaque agitée.
      2. Diluez le réactif de quantification de l’ADNdb 1:200 dans 1 tampon TE et ajoutez 55 μl du réactif dilué à chaque échantillon dans la microplaque à 96 puits. Bien mélanger à l’aide d’un agitateur et incuber 2 à 5 min à température ambiante, dans l’obscurité.
      3. Mesurez la fluorescence des échantillons à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence et de filtres pour les longueurs d'onde de fluorescéine standard (excitation ~480 nm, émission ~520 nm).
      4. Pour obtenir la concentration en ADN bactérien, tracez les lectures de fluorescence dans le graphique obtenu au point 1.5.1.4. Divisez la concentration d’ADN par la masse du génome de Coxiella (2,2 fg) pour obtenir des concentrations bactériennes. Exprimer les résultats en équivalent génome/ml.
      5. Écartez les mutants présentant un défaut de croissance significatif chez ACCM-2.

2. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) d’une colonie d’amorces uniques, séquençage et annotation

REMARQUE : Le protocole suivant est pour l’amplification de l’ADN de 96 échantillons, une pipette multicanaux est recommandée pour les étapes suivantes. La purification en colonne de produits PCR à l’aide de billes magnétiques et du séquençage de l’ADN avec une amorce spécifique au transposon (2.3) est sous-traitée à une société externe.

1. S’assurer que l’amorce d’amplification est conçue de manière à hybrider entre 100 et 200 paires de bases en amont de la répétition en tandem inversé (ITR), afin d’obtenir des produits de PCR couvrant le site d’insertion du transposon sur le génome de Coxiella. Préparez 3 ml de mélange PCR (1 tampon haute fidélité, 200 μM de désoxynucléoside triphosphate (dNTP), 1 μM d’amorce d’amplification, 20 U/ml d’ADN polymérase haute fidélité) et distribuez 29 μl par puits dans une plaque de PCR de 96 puits posée sur de la glace. Transférez 1 μl de chaque mutant en phase stationnaire dans ACCM-2 dans le mélange PCR.
2. Exécution de la PCR avec dénaturation initiale (98 °C, 1 min), 20 cycles de haute rigueur (98 °C, 10 s ; 50 °C, 30 secondes ; 72 °C, 90 secondes), 30 cycles de faible rigueur (98 °C, 10 secondes ; 30 °C, 30 secondes ; 72 °C, 90 secondes) et 30 cycles de haute rigueur (98 °C, 10 secondes ; 50 °C, 30 sec ; 72 °C, 90 s) suivie d’une dernière extension à 72 °C pendant 7 min.
3. Purifiez les produits PCR à l’aide de billes magnétiques et séquencez l’ADN avec une amorce spécifique au transposon. Concevez l’amorce spécifique au transposon avec une température de fusion prévue comprise entre 50 °C et 75 °C, une teneur en GC comprise entre 40 % et 60 %, une longueur comprise entre 18 et 25 nucléotides, et un site de recuit en aval du site d’hybridation de l’amorce d’amplification et au moins 100 paires de bases en amont de la première paire de bases du transposon ITR.
4. À l’aide d’un logiciel d’analyse de séquençage, chargez le génome complet et annoté de Coxiella burnetii 493 NMI. Utilisez la fonction « aligner sur la référence » pour charger et aligner (dynamiter) les résultats de séquençage et déterminer le site de transposition. Éliminez les mutants avec des lectures non correspondantes et/ou affichant des lectures doubles. Pour surveiller la saturation de la banque de mutants, tenez un registre de l’occurrence de plusieurs insertions de transposons au même site.

3. Défi des cellules eucaryotes avec des mutants Coxiella et surveillance de la croissance intracellulaire

REMARQUE : Une pipette multicanaux est recommandée pour les étapes suivantes. Les infections ont été réalisées en trois exemplaires dans des microplaques stériles à 96 puits avec des parois noires et des fonds plats transparents. Wt Coxiella burnetii exprimant la GFP a été fourni par le Dr Robert Heinzen.

1. Cultivez des cellules Vero dans un RPMI sans rouge de phénol complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) en l’absence d’antibiotiques (milieu RPMI complet).
2. La veille de l’infection, laver les cellules Vero d’un flacon de culture cellulaire confluent ou sous-confluent avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Détachez les cellules Vero en ajoutant 1 ml de solution de trypsine EDTA dans le ballon de culture cellulaire et incubez pendant 3 à 5 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
4. Remettre les cellules en suspension dans 10 ml de support Complete RPMI. Compter les cellules et préparer une suspension cellulaire de 10^{à 5} cellules par ml.
5. Distribuez 100 μl de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque noire de 96 puits à fond plat et transparent.
6. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g à température ambiante (RT) pour faciliter l’adhésion cellulaire au fond des puits et incuber une nuit à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
7. Décongelez les plaques à 96 puits contenant les mutants Coxiella à RT et diluez 150 μl de suspension bactérienne dans 300 μl de RPMI sans rouge de phénol et FBS dans une plaque à 96 puits profonds.
8. Retirez le milieu de la microplaque contenant les cellules Vero et distribuez 100 μl/puits de mutants Coxiella dilués (MOI de 100). Utiliser bien A1 comme témoin négatif (cellules non infectées) et puits A2 et A3 comme témoins positifs (cellules infectées par Wt Coxiella exprimant la GFP à des multiplicités d’infections (MOI) de 100 et 200).
9. Centrifuger la plaque pendant 10 min à 400 x g à RT à l’aide d’un support de plaque de centrifugation étanche aux aérosols.
10. Incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 2 heures, puis remplacer le milieu contenant des bactéries par 100 μl/puits de milieu RPMI frais et complet.
11. Mesurez la fluorescence GFP tous les jours pendant 7 jours à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence et de filtres pour les longueurs d’onde de fluorescéine standard (excitation ~480 nm, émission ~520 nm). Pour éviter les interférences dues à la condensation et à la dispersion du signal dans le milieu de culture, utilisez l’excitation par le bas et l’enregistrement d’émission sur le lecteur de microplaques.

4. Préparation des échantillons pour l’acquisition automatique d’images

REMARQUE : La procédure consiste pour une plaque de 96 puits, augmentez les volumes en conséquence. Les étapes de 4.2 peuvent tirer parti d’un rondeur de plaques.

1. Le 7^e jour après l’infection, retirer le milieu de la plaque et le remplacer par 50 μl/puits de milieu frais et complet contenant un colorant fluorescent perméable aux cellules à la dilution appropriée (généralement 1:1 000, à optimiser en fonction de la lignée cellulaire utilisée). Incuber les cellules pendant 30 à 60 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
2. Remplacer le milieu par 50 μl/puits de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS, incuber pendant 30 min à température ambiante (RT), puis retirer le tampon contenant du PFA et laver 3 fois avec du PBS.
3. Retirer le PBS et distribuer 50 μl/puits de solution bloquante (0,5 % d’albumine sérique bovine, 50 mM de chlorure d’ammonium, NH₄Cl dans du PBS, pH 7,4) complété par 0,05 % de saponine. Incuber à RT pendant 30 min.
4. Remplacer la solution bloquante par 40 μl/puits de solution bloquante fraîche complétée par de la saponine (comme ci-dessus) et par un anticorps anti-glycoprotéine membranaire-1 associé au lysosome (anti-LAMP1) à une dilution de 1:500. Incuber la plaque pendant 30 min à RT.
5. Retirez la solution de blocage et lavez la plaque à 96 puits 5 fois avec 100 μl/puits de PBS.
6. Distribuer 40 μl/puits de solution bloquante complétée par de la saponine (comme ci-dessus), l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence (à une dilution de 1:1 000) pour révéler l’anticorps anti-LAMP1 appliqué à l’étape 4.4, et avec Hoechst 33258 à 5 μg/ml. Plaque d’incubation pendant 30 min à RT.
7. Retirez la solution de blocage et lavez la plaque à 96 puits 5 fois avec 100 μl/puits de PBS. Laissez le volume de PBS correspondant au dernier lavage dans la plaque à 96 puits, car les cellules fixes ne doivent pas se dessécher.
8. Imagez immédiatement la plaque ou stockez-la à 4 °C, à l’abri de la lumière, pour une analyse ultérieure.

5. Acquisition d’images

1. Acquérez des images dans les canaux GFP (488 nm, bactéries), Hoechst 33258 (350 nm, noyaux de cellules hôtes), rouge (~555 nm, marqueur de membrane cellulaire) et rouge lointain (~615 nm, LAMP1) à l’aide d’un microscope automatisé à épifluorescence équipé d’un objectif 20X. Acquérir 21 champs indépendants par puits afin d’imager un minimum de 5 000 cellules par échantillon. Appliquez la mise au point automatique en utilisant le canal des noyaux de la cellule hôte comme référence. Lorsqu’ils travaillent avec des agents pathogènes bactériens infectant un faible pourcentage de cellules hôtes, les utilisateurs peuvent ajuster le nombre de champs indépendants imagés par puits, afin d’obtenir un minimum de 500 cellules infectées à analyser.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
acide citrique	sigma	C0759-500G	ACCM-2 Composant moyen
Citrate de sodium	sigma	S4641-500G	ACCM-2 Composant moyen
Phosphate de potassium	sigma	Référence 60218-100G	ACCM-2 Composant moyen
chlorure de magnésium	sigma	M2670-100G	ACCM-2 Composant moyen
Chlorure de calcium	sigma	Réf. C5080-500G	ACCM-2 Composant moyen
Sulfate de fer	sigma	F8633-250G	ACCM-2 Composant moyen
chlorure de sodium	sigma	S9625-500G	ACCM-2 Composant moyen
L-cystéine	sigma	Réf. C6852-25G	ACCM-2 Composant moyen
Bacto Néopeptone	BD (Beckton-Dickinson)	211681	ACCM-2 Composant moyen
Acides aminés	BD (Beckton-Dickinson)	Référence 223050	ACCM-2 Composant moyen
Méthyl-B-cyclodextrine	sigma	Réf. C4555-10G	ACCM-2 Composant moyen
RPMI avec glutamax	Gibco	Référence 61870-010	ACCM-2 Composant moyen
RPMI avec glutamax, sans rouge de phénol	Gibco	Référence 32404-014	Pour la culture cellulaire et l’infection
Sérum fœtal bovin	GE Soins de santé	SH30071	Pour la culture cellulaire
Trypsine EDTA (0,25 %)	Technologies de la vie	Référence 25200-056	Pour la culture cellulaire
saponine	sigma	Réf. 47036	Pour la coloration par immunofluorescence
Chlorure d’ammonium	sigma	N° A9434	Pour la coloration par immunofluorescence
Albumine sérique bovine	sigma	A2153	Pour la coloration par immunofluorescence
Cuvette d’électroporation 0,1 cm	Eurogentec	CE0001-50	Pour la transformation de Coxiella
Tubes supérieurs à vis Trackmates avec capuchons	Thermo Scientific	Référence 3741	Bouchon à vis à code-barres 2D
Microplaque de 96 puits avec parois et fond noirs	Greiner	655076	Fond sombre plat, pour la quantification de l’ADNdb
Microplaque à 96 puits, transparente, parois noires	Greiner	Référence 655090	Fond plat transparent, pour la culture cellulaire et l’imagerie
Microplaque PCR à 96 puits	Biorad	2239441	Sans DNAse/ARNase
Plaque à 96 puits, Deepwell	Labcon	949481	Pour les infections à Coxiella mutants
PicoVert	Technologies de la vie	P7581	Pour la quantification de l’ADNdb
Triton X-100	sigma	Réf. T9284-500ML	Pour la quantification de l’ADNdb
Phusion ADN polymérase haute fidélité	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0530L	Pour la PCR de colonie d’amorce unique
Celltracker Rouge CMTPX	Technologies de la vie	Réf. C34552	Pour l’imagerie
Anticorps anti-LAMP1	sigma	Référence 94403-1ML	Pour la coloration par immunofluorescence
Hoechst 33258	sigma	N° L1418	Pour l’imagerie
Lecteur de microplaques à fluorescence Infinite 200 Pro	Técan
Microscope automatisé à épifluorescence Cellomique	Thermo Scientific