Les protocoles suivants décrivent les méthodes de culture et d’étude de l’invasion par l’espèce anaérobie P. gingivalis ; cependant, ces protocoles peuvent être utilisés pour un certain nombre d’agents pathogènes anaérobies. Bien que les HUVEC soient utilisés, ce protocole peut être utilisé pour d’autres cellules eucaryotes immunitaires et non immunitaires.
1. Utilisation et entretien de la chambre anaérobie
Remarque : P. gingivalis est un anaérobie sensible aux niveaux normaux d’oxygène présents dans l’air ambiant. Un environnement anaérobie contrôlé est vital pour la culture de P. gingivalis.
- Ici, maintenez une atmosphère artificielle désignée comme gaz anaérobie mixte (80 % N2, 10 % H2, 10 % CO2) dans une chambre anaérobie en vinyle (Figure 1A). Utilisez un sas (figure 1B) pour transférer les articles du laboratoire à la chambre anaérobie. Le sas fonctionne manuellement, avec deux purges avec du gazN2 avant d’introduire le gaz anaérobie mélangé.
- Utilisez une colonne d’élimination du sulfure d’hydrogène (figure 1C) pour éliminer sans entretien le sulfure d’hydrogène indésirable. Placez un déshumidificateur à l’intérieur de la chambre pour éliminer le H2O créé par le catalyseur et pour éviter les aérosols qui facilitent la propagation de la contamination.
note: Le sulfure d’hydrogène est un sous-produit métabolique naturel de nombreuses bactéries anaérobies, et son accumulation est toxique pour les bactéries et peut endommager l’électronique et réduire la durée de vie d’un catalyseur.
- À l'aide d'un ventilateur, faites circuler l'atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, qui élimine l'oxygène en présence d'hydrogène (Figure 1D).
Remarque : Un filtre atmosphérique à recirculation (HEPA) élimine les contaminants en suspension dans l’air d’une taille de 0,22 m ou plus.
- Cultivez des bactéries anaérobies dans un incubateur à 37 °C situé à l’intérieur de la chambre anaérobie. Utilisez des techniques d’asepsie standard lorsque vous travaillez à l’intérieur de la chambre anaérobie.
2. Préparation des bactéries anaérobies
Remarque : P. gingivalis est aérotolérant et peut être stocké dans des conditions aérobies, mais il ne se développera pas en présence d’oxygène à des niveaux supérieurs à 6 %. Une chambre anaérobie est nécessaire pour la bonne culture de P. gingivalis et d’autres espèces anaérobies (figure 1). Une formation et une éducation appropriées sur l’utilisation de la chambre anaérobie sont nécessaires avant de travailler avec des micro-anaérobies.
- Équilibrer tous les milieux liquides et les plaques dans des conditions anaérobies pendant au moins 12 heures avant l’expérimentation afin d’éliminer l’oxygène résiduel.
- Transférez P. gingivalis d’un congélateur à -80 °C dans une chambre anaérobie et laissez décongeler.
- Striure de P. gingivalis sur plaques de gélose au sang de soja trypticase (TSA II avec 5 % de sang de mouton). Enveloppez les plaques dans du parafilm et conservez-les à 37 °C dans un incubateur anaérobie pendant 4 à 7 jours.
- Inculquer P. gingivalis dans un bouillon de perfusion cerveau-cœur (BHI) de 3 ml complété par de l’hémine et de la ménadione, un milieu liquide non sélectif enrichi pour l’isolement et la culture de micro-organismes anaérobies et exigeants, à l’aide de boucles stériles.
note: Pour un stockage à long terme, mélanger les cultures bactériennes préparées dans du BHI avec du glycérol ou du DMSO (concentration finale de 10 à 20 %) et les placer au congélateur à -80 °C.
- Préparez une culture de démarrage de P. gingivalis en faisant une dilution de 1:10 et en laissant les bactéries se développer jusqu’à la phase mi-loglog.
Remarque : La densité optique de la suspension bactérienne est déterminée et la concentration bactérienne de chaque souche à examiner est ajustée. Pour P. gingivalis, une suspension à OD660 de 0,7 correspond à la phase mi-log et à ~7 x 10,8 cellules/ml. Les conditions de croissance décrites dans le protocole ci-dessus sont spécifiques à P. gingivalis et peuvent devoir être adaptées à d’autres souches bactériennes.
3. Culture de cellules endothéliales
Remarque : Achetez des HUVECs primaires regroupés et une culture dans un milieu basal contenant des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) à 37 °C dans 5 % de CO2 selon les instructions du fabricant.
- HUVECs de semences en flacons T-75 de 2,5 x 105 cellules/ballon en 15 ml VEGF media.
note: Vérifier la viabilité par une dilution 1:1 avec 4,0 % de bleu de trypan. Les cellules dont la membrane est compromise conservent le bleu trypan, et les cellules saines dont les membranes sont intactes apparaissent blanches lorsqu’elles sont observées au microscope binoculaire. Comptez 100 cellules et assurez-vous que plus de 80 % des cellules sont viables.
- Remplacez le milieu tous les 2 jours par un milieu VEGF frais préchauffé jusqu’à ce que les cellules atteignent ~80 % de confluence.
- Lavez les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée. Libérez les cellules de la fiole T75 en les incubant avec 2 ml de trypsine-EDTA (0,25 %) pendant 5 minutes, puis avec 2 ml de solution neutralisante de trypsine.
- Recueillir les HUVECs en suspension dans un tube conique de 50 ml. Lavez toutes les cellules supplémentaires des flacons T-75 avec du PBS et transférez-les dans des tubes coniques de 50 ml.
- Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 10 min.
- Retirer le surnageant et suspendre la pastille cellulaire dans un milieu VEGF préchauffé de 10 ml.
- Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un appareil de comptage cellulaire similaire.
- Calculez la quantité de suspension cellulaire à ajouter à une plaque de 6 puits (400 000/puits) ou à une plaque de 12 puits avec lamelles de recouvrement (50 000/puits). Les HUVECs seront prêts pour l’expérimentation le lendemain.
4. Essai de survie Invasion/Interaction (Plating)
Remarque : Lors de l’exécution de ce test, préparez deux plaques de cellules endothéliales à 6 puits ensemencées à 400 000 cellules/puits. Une plaque sera utilisée pour évaluer les bactéries attachées et internalisées par les cellules hôtes. L’autre plaque tiendra compte des bactéries intracellulaires. La plaque à 6 puits permet de réaliser des triplés de deux échantillons en une seule expérience. Pour un aperçu de ce protocole, veuillez consulter l’organigramme de l’essai de survie (figure 2).
- Préparez les bactéries anaérobies comme décrit ci-dessus (voir rubrique 1) jusqu’à ce qu’elles atteignent une croissance mi-log (DO660 0,5-0,7).
- Centrifuger les bactéries à 5 000 x g pendant 10 min
Remarque : Si la centrifugeuse se trouve à l’extérieur d’une chambre anaérobie, transportez les échantillons de bactéries dans un tube de 15 ml hermétiquement fermé et enveloppez le capuchon avec du parafilm pour éviter les fuites d’oxygène.
- Remettez P. gingivalis en granulés dans la chambre et jetez le surnageant. Laver avec du PBS et granuler à nouveau les bactéries avant de les remettre en suspension dans le milieu VEGF. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à la DO660 de 0,7, ce qui correspond à la phase mi-log (~7 x 10,8 cellules/ml). La bactérie est maintenant prête pour l’infection.
- Transférez des plaques à 6 puits contenant des HUVECs de l’incubateur de culture tissulaire dans la chambre anaérobie. Retirez le support et lavez-le trois fois avec du PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu anaérobie VEGF dans chaque puits et placer les plaques à 37 °C dans l’incubateur anaérobie pendant 20 min pour équilibrer la température d’infection.
note: Placez les bactéries sur des plaques de gélose au sang pour vous assurer que celles utilisées pour l’infection sont homogènes et ne sont pas contaminées lors de l’infection.
- Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d’infection (bactéries MOI : hôte) de 100:1.
note: Le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d’exclusion de trypan sur un seul puits avant l’infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (p. ex., DO de 0,5 = 5 x 108 cellules/ml). La concentration bactérienne est ajustée au MOI approprié en fonction de la concentration de HUVEC.
- Placez des plaques à 6 puits contenant des HUVECs infectés dans l’incubateur anaérobie et laissez les bactéries interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min.
- Préparez la saponine dans du BHI (1,0 % p/v) à l’intérieur de la chambre anaérobie et filtrez à travers un filtre de 0,2 μm.
- Survie des bactéries attachées et internalisées.
- Retirer les plaques de l’incubateur, aspirer le milieu, laver trois fois avec du PBS anaérobie et ajouter 2 ml de saponine filtrée à 1,0 % (préparée comme décrit à l’étape 4.8). Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
- Raclez le fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange cellulaire de chaque puits et faire une dilution 1:1 dans BHI.
- Procédez à des dilutions en série de l’échantillon. En fonction de l’espèce bactérienne et de la concentration, ajustez les dilutions en série. Commencez par des dilutions de 1:100 ou 1:1 000.
- Plaque de 200 μl de dilution souhaitée sur plaques de gélose au sang. Enveloppez les plaques dans du parafilm et placez-les dans l’incubateur anaérobie à 37 °C.
- Après sept jours d’incubation à 37 °C, retirez les plaques et comptez les unités formant colonies (UFC) à l’aide d’une boîte lumineuse pour compter manuellement les colonies.
note: Les UFC sont énumérées. Pour de plus grandes quantités d’UFC, des images peuvent être prises et des logiciels peuvent être utilisés pour faciliter le dénombrement des UFC.
