$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Internalisation des bactéries dans les cellules hôtes (microscopie fluorescente)
Remarque : P. gingivalis est marqué avec de l'ester acétoxyméthylique (BCECF-AM) de 2',7'-Bis-(2-Carboxyéthyl)-5-(et-6)-Carboxyfluorescéine. BCECF-AM est un colorant non perméable à la membrane fluorescente ; sa conversion en fluorescéine BCECF via l’action des estérases intracellulaires peut indiquer la viabilité cellulaire. P. gingivalis est marqué avec le colorant BCECF-AM, puis utilisé pour infecter les cellules eucaryotes. Après l’infection, les cellules sont fixées et marquées avec du DAPI et de la TRITC-phalloidine. La coloration DAPI utilisée pour colorer le noyau de la cellule eucaryote marquera également le noyau cellulaire bactérien, ce qui fournit une contre-mesure pour identifier les bactéries non viables qui ne peuvent pas cliver métaboliquement BCECF-AM. Les cellules hôtes sont mises en évidence avec de la TRITC-phalloidine, un colorant d’actine rouge.
- Couvre-slips d’autoclave. Ajouter de manière aseptique des lamelles sur des plaques de 12 puits avant d’ensemencer des cellules endothéliales à 5 x 104 cellules/puits. (Préparé la veille de l’expérience)
- Faire préparer les cellules endothéliales sur des lamelles circulaires de 18 mm (épaisseur #1,5) en plaques de 12 puits, comme décrit ci-dessus.
- Préparez des bactéries anaérobies cultivées jusqu’à la phase mi-log (DO660 = 0,5-0,7).
- Laver les bactéries 2 fois avec du PBS anaérobie en centrifugeant à 5 000 x g et en suspendant le granulé dans du PBS à 5-7 x 108 cellules/ml.
- Ajouter 20 μl de 0,2 mM DE BCECF-AM à 2 ml de suspension bactérienne (5-7 x 108 cellules/ml) jusqu’à une concentration finale de BCECF-AM de 2 μM.
- Incuber à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
- Plaques de transfert avec des cellules endothéliales ensemencées sur des lamelles circulaires de 18 mm (épaisseur #1,5) de l’incubateur de culture tissulaire dans la chambre anaérobie. Laver avec du PBS et remplacer avec un média VEGF anaérobie.
Remarque : Vérifiez que les HUVECs sont sains au microscope optique. Les HUVECS doivent être confluents à ~80 %, la morphologie doit être comparable à celle des fabricants.
- Centrifugeuse étiquetée les bactéries à 5 000 x g pendant 10 min pour éliminer le colorant BCECF-AM résiduel. Suspendre dans un milieu anaérobie VEGF de 2 ml.
- Infecter les cellules hôtes avec des bactéries marquées à un moment d’inertie de 100:1 (bactéries : hôte).
- Incuber dans une chambre anaérobie à 37 °C pendant 30 min.
- Après l’infection, laver les cellules avec du PBS trois fois et fixer dans du paraformaldéhyde à 4,0 % fraîchement préparé pendant 10 min
note: Après avoir fixé les cellules, des expériences peuvent être menées à l’extérieur de la chambre anaérobie.
- Lavez les lamelles avec du PBS trois fois.
- Ajouter 1 ml de Triton X-100 à 0,2 % pendant 10 min.
- Lavez les lamelles avec du PBS trois fois.
- Ajouter 50 μl de phalloïdine TRITC (50 μg/ml) sur les lamelles pendant 45 min.
- Lavez les lamelles trois fois, retirez-les de la plaque à 12 puits et placez-les sur une lame avec un support de montage souple contenant du DAPI. Scellez les côtés avec du vernis à ongles.
note: Les lames peuvent être stockées pendant quelques mois dans l’obscurité. Évitez l’exposition à la lumière pour éviter le photo-blanchiment.
- Visualisez des lames à l’aide d’un microscope confocal.
- Ici, utilisez un système spectral à 34 canaux (détecteur à réseau 32 canaux et deux détecteurs PMT latéraux, plus un détecteur à lumière transmise) configuré autour d’un support AxioObserver (inversé) avec une platine XY motorisée. Le système dispose de cinq lasers : diode bleue (405 nm), argon multiligne (458, 488, 514 nm), diode verte (561 nm), HeNe rouge (633 nm) et un laser pulsé de 440 nm. Equiper un système d’imagerie à vie de fluorescence avec 2 détecteurs GaAsP hybrides (pour FRET-FLIM).
- Détectez la fluorescence de DAPI et TRITC dans un canal à l’aide d’un filtre bibande avec des longueurs d’onde d’excitation de 340-380 nm et 540-560 nm, et d’un filtre d’émission de 435-485 nm et 570-590 nm respectivement. Détecter la fluorescence de BCECF-AM à l’aide d’un filtre avec une longueur d’onde d’excitation de 440-500 nm et un filtre d’émission de 510-590 nm.
note: Des contrôles pour BCECF-AM devraient être effectués sur chaque souche bactérienne étudiée afin d’assurer un étiquetage adéquat des bactéries viables. Valider d’abord que les bactéries non viables sont positives pour le DAPI et négatives pour le BCECF. Deuxièmement, assurez-vous que les bactéries vivantes peuvent métaboliser BCECF-AM en fluorescéine BCECF. Il peut être nécessaire d’analyser des concentrations variables de bactéries ou de colorant BCECF-AM pour un étiquetage optimal.