1. Culture, différenciation et validation des cellules HL-60
- Préparez un milieu de culture cellulaire HL-60 composé de 500 ml de sérum fœtal bovin (RPMI) de 500 ml de L-glutamine et de 50 ml de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela pourrait affecter la différenciation des cellules HL-60.
- Pour la multiplication/l’entretien des cellules HL-60, culture de 5 x 10 6 cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaires HL-60 dans2 flacons ventilés de 75 cm à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2). Passage des cellules tous les 3 à 4 jours pour maintenir des concentrations cellulaires optimales.
note: La concentration cellulaire ne doit pas dépasser 5 x 106/mL.
- Générer des stocks de travail de cellules HL-60 en aliquotant environ 1 x 106 cellules/mL dans des milieux de culture HL60 avec 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans des tubes cryogéniques de 1 mL.
note: Les stocks de travail peuvent être stockés à -80 °C. Le stock principal doit être stocké à -120 °C.
- Différencier les cellules HL-60 en cultivant 1,5 x 107 cellules dans 15 mL de milieu de culture cellulaire HL-60 avec 0,6 % de N, N-diméthylformamide (DMF) à 37 °C et 5 % de CO2 dans des flacons stériles de 75 cm2 recouverts d’un filtre pendant 3 jours avant l’activité de destruction des opsonophagocytes (OPKA).
- Valider que les cellules HL-60 ont été différenciées avec succès et qu’elles sont appropriées pour une utilisation dans le test OPKA en testant la viabilité et les marqueurs de surface cellulaire conformément aux protocoles de cytométrie en flux établis. Après la différenciation, récoltez les cellules HL-60 et colorez environ 1 x 10cellules 4 avec des anticorps/colorants conjugués par fluorescence pour CD71, CD35, l’annexine V et l’iodure de propidium.
note: Les cellules différenciées doivent être viables à ≥65 %, à ≥55 % de CD35+ et à ≤20 % de CD71+, selon les protocoles de validation établis (figure 1).
2. Préparation des tampons et réactifs OPKA
- Préparez 50 mL de tampon d’opsonisation B stérile (OBO) en mélangeant 42,5 mL de solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS) avec du Ca2+/Mg2+, 5 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 2,5 mL de gélatine stérile à 0,1 %. Conserver à 4 °C.
- Procurez-vous le complément pour bébé lapin et conservez-le à -80 °C.
- Obtenir ou préparer des plaques de culture bactérienne (c.-à-d. des plaques de gélose au sang de mouton de 15 x 100 mmà 2 % à 5 %).
3. Préparation des échantillons de stock bactérien
- Obtenir un stock de la ou des souches bactériennes à tester.
REMARQUE : Pour ce protocole, le sérotype 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, généreusement fourni par le Dr Moon Nahm) est utilisé.
- Cultiver la souche bactérienne dans un bouillon approprié (c.-à-d. bouillon Todd-Hewitt + 0,5 % d’extrait de levure pour cette souche WU2) pendant environ 2 à 4 h à 37 °C
note: La densité optique à 600 nm (OD600) de la culture doit être comprise entre 0,6 et 0,8.
- Granulez les bactéries par centrifugation à 6 000 x g pendant 2 min et remettez les cellules en suspension dans 10 à 30 ml de glycérol à 15 % dans le bouillon approprié. Aliquote la culture bactérienne (500 μL par aliquote) dans des tubes à centrifuger stériles de 1,5 mL et conserver à -80 °C.
- Décongelez un flacon de bouillon bactérien dans un bain-marie à 37 °C. Granulez les cellules bactériennes et mettez-les en suspension dans 500 μL d’OBB dans des conditions stériles.
- Préparez différentes dilutions du stock bactérien dans l’oxyde de biofusion (c.-à-d. 10 μL de non-dilution, 10 μL de 1:10, 10 μL de 1:100, etc.). Effectuer le test OPKA (sections 4 à 6, y compris la co-culture HL-60/complément) comme décrit ci-dessous en utilisant diverses dilutions de la souche bactérienne non traitée. Cultivez les plaques pendant la nuit à 30 °C (pas de CO2).
note: La température de 30 °C est spécifique pour WU2 afin d’éviter la prolifération ; d’autres souches/sérotypes peuvent se développer de manière optimale à 37 °C.
- Compter les colonies pour chaque dilution de stock bactérien non traité co-cultivé avec des cellules HL-60 et du complément. Déterminer quelle dilution de bactéries permet d’obtenir le nombre optimal de colonies dénombrables (environ 80 à 120 unités formant colonies (UFC) pour les bactéries non traitées co-cultivées avec des cellules HL-60). Notez cette dilution pour les futurs OPKA impliquant ce stock bactérien.
4. Traitement et culture bactériennes
- Décongelez un tube de bouillon bactérien préparé à l’étape 3.3. Bactéries du granulé (6 000 x g pendant 2 min) et remettre en suspension le culot cellulaire dans l’OBE à la dilution optimale, comme déterminé à l’étape 3.6.
- Pipette 10 μL de dilution bactérienne remise en suspension par puits dans une plaque de culture cellulaire à fond rond de 96 puits.
- Ajouter 20 μL d’anticorps ou de traitement médicamenteux approprié dans chaque puits expérimental en double.
REMARQUE : Dans ce protocole, un anticorps spécifique du sérotype généré chez la souris est ajouté comme traitement X, et une enzyme glycoside hydrolase connue pour dégrader la capsule polysaccharidique du sérotype 3 est ajoutée comme traitement Y (figure 2). Pour les puits de contrôle, utilisez 1x PBS ou OBB, selon le tampon utilisé pour les puits de traitement.
- Agitez la plaque d’échantillonnage à environ 90 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Ajustez ces conditions en fonction de la température optimale ou des conditions d’agitation des traitements testés.
5. Co-culture bactérienne HL-60
- Préparez les cellules HL-60 en récoltant les cellules différenciées HL-60 qui sont traitées avec du DMF trois jours avant (voir l’étape 1.4) dans des tubes coniques de 15 ml. Granulez les cellules (500 x g, 3 min), jetez le surnageant et lavez-les avec au moins 10 ml de 1x PBS.
- Granulez les cellules lavées (500 x g, 3 min), jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans l’OBB (en commençant par 1 mL d’OBB et en ajustant pour obtenir une concentration finale de 1 x 107/mL après le comptage des cellules).
- Ajouter le complément pour bébé lapin (sérum stérile et non dilué pour bébé lapin, âgé de 3 à 4 semaines) à un volume final de 1:5.
note: La concentration finale du mélange HL-60-complément doit être de 1 x 107/mL. Si l’on teste la dépendance du complément, une deuxième solution contenant des cellules HL-60 actives avec un complément inactivé par la chaleur peut être utilisée (le complément peut être inactivé en l’incubant dans un bain-marie à >55 °C pendant au moins 30 min).
- Une fois la culture bactérienne terminée pendant 1 h (étape 4.4), divisez chaque échantillon (c.-à-d. 10 μL de chaque puits d’échantillon de 30 μL dans deux nouveaux puits) en deux puits doubles pour deux groupes (c.-à-d. utilisez seulement 20 μL de la coculture originale de 30 μL pour tenir compte de l’erreur de pipetage) : un ensemble sera co-cultivé avec le complément HL-60 et l’autre comprendra uniquement des bactéries. Ajouter 50 μL du mélange HL-60-complément (à partir de l’étape 5.3) dans chaque ensemble expérimental de puits (délégué +HL-60) ; ajouter 50 μL de BOB seul dans les puits de bactéries seulement (délégué -HL-60).
note: Pour cet exemple, environ 800 UFC bactériennes sont utilisées pour la co-culture initiale avec 5 cellules HL-60 de10 5/50 μL. Si cette multiplicité d’infection est trop élevée ou trop faible, comme l’indiquent les nombres finaux de colonies, ajustez la dilution bactérienne initiale par rapport au nombre de cellules HL-60.
- Agitez la plaque à 96 puits à 37 °C pendant 1 h (pas de CO2).
6. Placage de l’échantillon et incubation pendant la nuit
- Diluer chaque puits 1:5 avec de l’OBB, de sorte que chaque échantillon ait un volume d’au moins 50 μL.
- Pipeter 50 μL de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, en veillant à ce que l’espacement soit adéquat entre les échantillons. Pour 15 x 100 mm2 plaques de gélose rondes, pipeter environ 4 échantillons sur une plaque.
- Couvrir et laisser sécher les échantillons pendant environ 15 minutes à température ambiante.
- Retournez les plaques et cultivez toute la nuit à 30 °C (pas de CO2). Alternativement, des plaques de culture dans des bocaux anaérobies pour tester si les conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou pour contrôler la morphologie.
- Après une culture pendant la nuit, comptez les colonies dans chaque zone d’échantillonnage désignée. Analysez les données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque ensemble au témoin correspondant et/ou aux échantillons qui ne reçoivent pas de co-culture de cellules HL-60 (indicateur de 100 % de survie cellulaire, 0 % de destruction cellulaire).
