Évaluation de Porphyromonas gingivalis internalisée dans les cellules endothéliales de l’hôte

Résumé

Source : Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test permettant d’évaluer la survie de Porphyromonas gingivalis à l’intérieur des cellules endothéliales humaines. La mesure de la survie et de la croissance de Porphyromonas gingivalis internalisée est évaluée par le nombre de colonies sur la plaque de gélose au sang.

Protocole

1. Survie des bactéries internalisées.

1. Préparez les bactéries anaérobies de P. gingivalis jusqu’à ce qu’elles atteignent une croissance mi-log (DO₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifuger les bactéries à 5 000 x g pendant 10 min.
3. Remettez la pastille de P. gingivalis dans la chambre et jetez le surnageant. Laver avec du PBS et granuler à nouveau les bactéries avant de les remettre en suspension dans le milieu VEGF. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à la DO₆₆₀ de 0,7, ce qui correspond à la phase mi-log (~7 x 10,⁸ cellules/ml). La bactérie est maintenant prête pour l’infection.
4. Transférez des plaques à 6 puits contenant des HUVECs de l’incubateur de culture tissulaire dans la chambre anaérobie. Retirez le support et lavez-le trois fois avec du PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu anaérobie VEGF dans chaque puits et placer les plaques à 37 °C dans l’incubateur anaérobie pendant 20 min pour équilibrer la température d’infection.
5. Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d’infection (bactéries MOI : hôte) de 100:1.
   note: Le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d’exclusion de trypan sur un seul puits avant l’infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (p. ex., DO de 0,5 = 5 x 10⁸ cellules/ml). La concentration bactérienne est ajustée au MOI approprié en fonction de la concentration de HUVEC.
6. Placez des plaques à 6 puits contenant des HUVECs infectés dans un incubateur anaérobie et laissez les bactéries interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min.
7. Préparez la saponine dans du BHI (1,0 % p/v) à l’intérieur de la chambre anaérobie et filtrez à travers un filtre de 0,2 μm.
8. Retirez les plaques de l’incubateur. Laver trois fois avec du PBS anaérobie et ajouter 2 ml de milieu VEGF avec un antibiotique supplémenté (300 μg/ml de gentamicine et 400 μg/ml de métronidazole).
9. Incubez pendant 1 heure. Assurez-vous de tester les antibiotiques afin qu’ils soient efficaces à 100 % pour tuer la souche bactérienne souhaitée et assurez-vous qu’ils ne pénètrent pas dans les cellules hôtes.
10. Aspirer le média, ajouter 2 ml de saponine filtrée à 1,0 %. Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
11. Raclez le fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange cellulaire de chaque puits et faire une dilution 1:1 dans BHI.
12. Préparez des dilutions en série de l’échantillon (1:100, 1:1 000).
13. Plaque de 200 μl de dilution souhaitée sur plaques de gélose au sang. Enveloppez les plaques dans du parafilm et placez-les dans un incubateur anaérobie.
14. Après sept jours d’incubation à 37 °C, retirer les plaques et compter les UFC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre anaérobie en vinyle de type B	Produits de laboratoire Coy		Incubateur modèle 2000
Gélose de soja TSA II trypticase avec 5 % de sang de mouton	Bbl	221261
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine Pool de 10 donneurs	Technologie LifeLine	FC-0044
Kit complet VascuLife VEGF Medium	Technologie LifeLine	LL-0003
TrypKit	Lifeline	LL-0013
saponine	Riedel-de Haen	Référence 16109
Sel de sulfate de gentamicine	Sigma-Aldrich	G-1264
Métronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761