Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Expression et purification des anticorps
- Entretien des cellules ovariennes de hamster chinois (CHO)
- Cultivez des cellules CHO dans des milieux CHO FreeStyle complétés par un supplément de glutamine 1x disponible dans le commerce à 37 °C, en agitant à 130 tr/min avec 5 % de CO2 à l’aide de longs flacons Erlenmeyer en verre ou jetables.
note: Il est fortement recommandé d’utiliser une fiole à chicanes avec un capuchon ventilé pour une agitation accrue et pour améliorer le transfert de gaz dans des conditions d’agitation. Une réduction significative du rendement en anticorps a été obtenue avec des flacons ordinaires (non cloisonnés) en raison de l’agitation limitée de la culture en suspension.
- Maintenir le nombre de cellules entre 1 et 5 x 106 cellules/ml avec une viabilité cellulaire de >95 %. Si le nombre de cellules augmente au-delà de 5 x 106 cellules/ml, divisez les cellules. Ne laissez jamais les cellules CHO atteindre moins de 0,2 x 106 cellules/mL.
- Transfection des cellules CHO
- Cultivez des cellules CHO dans 200 mL de milieu (2 x 106 cellules/mL) dans des flacons à chicanes Erlenmeyer delong.
note: Les cultures en suspension cultivées dans des flacons à chicanes ont toujours produit des rendements en protéines plus élevés que lorsqu’elles sont cultivées dans des flacons non cloisonnés.
- Dans un tube de 15 ml, prélever 5 ml de milieu CHO FreeStyle et ajouter 50 μg d’ADN de clone VH et 75 μg d’ADN de clone VL. Vortex pour bien mélanger.
- Incuber le mélange d’ADN à température ambiante pendant 5 min
note: Une incubation plus longue réduit les rendements en protéines.
- Ajouter 750 μL de polyéthylèneimine (PEI) de 1 mg/mL à la solution d’ADN et agiter agressivement le mélange pendant 30 s. Incuber à température ambiante pendant 5 min
note: L’Île-du-Prince-Édouard doit être fraîche. Les multiples cycles de gel-dégel de l’Île-du-Prince-Édouard réduisent considérablement le rendement global.
- Ajoutez tout le mélange d’ADN et de PEI dans les cellules tout en secouant manuellement la fiole. Incuber immédiatement les longs flacons à chicanes Erlenmeyer avec des cellules à 37 °C en agitant à 130 tr/min.
- Expression
note: L’anticorps possède un peptide signal sécrétoire conçu à son extrémité N-terminale, ce qui aide les anticorps à être sécrétés dans le milieu.
- Cultivez les cellules transfectées à 37 °C, avec agitation à 130 tr/min le jour 1.
- Le jour 2, ajoutez 2 ml d’agent anti-agglomérant 100x et 2 ml de solution anti-anti-anti-mycosique 100x. Baisser la température (32-34 °C) et agiter à 130 tr/min.
- Tous les cinq jours, ajoutez 10 ml de tryptone N1 et 2 ml de supplément de glutamine 100x.
- Continuez à compter les cellules tous les trois jours à l’aide d’un hémocytomètre après avoir coloré une aliquote de cellules avec une coloration au bleu trypan. S’assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 %.
- Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps. Faites tourner la culture à 3000 x g, 4 °C pendant 40 à 60 min, puis filtrez le média transparent à l’aide de filtres à flacon de 0,22 μM.
- Purification
note: La purification des anticorps est effectuée à l’aide d’une colonne Protein-A disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), à l’aide d’une pompe péristaltique.
- Équilibrez la colonne avec le volume à deux colonnes de tampon de liaison (20 mM de phosphate de sodium à pH 7,4).
- Passer le média filtré contenant l’anticorps (obtenu à l’étape 1.3.5) dans la colonne à un débit de 1 mL/min.
- Lavez la colonne avec le volume à deux colonnes de tampon de liaison.
- Éluer l’anticorps en fractions de 500 μL à l’aide d’un tampon d’élution de 5 mL (30 mM d’acétate de sodium à pH 3,4).
- Neutraliser le pH de l’anticorps élué en ajoutant 10 μL de tampon de neutralisation (3 M d’acétate de sodium à pH 9) par fraction.
note: La fraction numéro 3-6 contient la majeure partie de l’anticorps. Il est conseillé de conserver toutes les fractions au cas où l’anticorps serait élué dans une fraction plus tardive que prévu.
- Mesurez la concentration d’anticorps purifiés à l’aide d’un spectrophotomètre en sélectionnant le protocole par défaut pour l’immunoglobuline G (IgG). La concentration finale de l’anticorps est obtenue en mg/mL en tenant compte du poids moléculaire et du coefficient d’absorption.
2. Marquage fluorescent
REMARQUE : Les anticorps sont marqués avec le colorant infrarouge qui contient un groupe réactif ester NHS, qui se couple aux protéines et forme un conjugué stable. Cette réaction est sensible au pH et fonctionne mieux à un pH de 8,5. Les conjugués fluorescents marqués avec le colorant présentent un maximum d’absorption de 774 nm et un maximum d’émission de 789 nm. Un pH de 8,5 est la clé d’une conjugaison efficace.
- Dialysez 0,5 mL de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse (0,1 à 0,5 mL) dans 1 L de tampon de conjugaison (50 mM de tampon phosphate à pH 8,5). Après 4 h, transférez la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialysez pendant la nuit.
- Mettre en place une réaction de conjugaison en ajoutant 0,03 mg d’IRDye 800CW pour 1 mg d’anticorps dans un volume de réaction de 500 μL.
note: IRDye 800CW est dissous dans du DMSO à une concentration de 10 mg/mL.
- Effectuer des réactions de marquage pendant 2 h à 20 °C.
note: L’augmentation du temps au-delà de 2 heures n’améliore pas l’étiquetage.
- Purifier les conjugués marqués par dialyse extensive contre 1x PBS.
- Estimez le degré de marquage en mesurant l’absorbance du colorant à 780 nm et l’absorbance de la protéine à 280 nm. La contribution du colorant au signal de 280 nm est de 3 %.
- Calculez le rapport colorant/protéine à l’aide de cette formule :
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3. Etudes de xénogreffes de souris
- Préparation des cellules tumorales pour l’injection
- Cultivez des cellules OVCAR-3 dans le milieu RPMI-1640, complétées par 10 % de FBS et 1x pénicilline-streptomycine.
- La veille de l’injection, sous-cultiver les cellules dans de nouvelles boîtes de culture de 100 mm avec 10 mL de milieu/boîte complet. Utilisez un nombre de cellules de 0,5-1 x 106 cellules/plat.
- Incuber les cultures à une température de 37 °C, à 95 % d’humidité et à 5 % de CO2 pendant 20 à 24 h.
- Le jour de l’injection, retirer le milieu de croissance des boîtes de culture. Rincez abondamment la couche cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans Ca2+/Mg2+ pour éliminer les cellules mortes, les débris cellulaires et toutes les traces de sérum, qui peuvent interférer avec l'action de la trypsine.
- Trypsinisez les cellules en ajoutant 1,0 à 1,5 mL de solution de trypsine-EDTA dans chaque plat et essayez d’étaler la solution en inclinant la boîte tout autour, puis en l’incubant à 37 °C pendant 5 à 10 min
note: Observez les cellules sous un microscope inversé pour vérifier l’état réel de trypsinisation. La sous-trypsinisation entraîne un nombre plus faible de cellules se détachant de la surface de la boîte de culture, la sur-trypsinisation induit un stress cellulaire. Il est donc important qu’une bonne trypsinisation soit faite.
- Ajoutez 1,0 à 1,5 ml de milieu de croissance complet dans chaque boîte pour arrêter l’action de la trypsine, puis remettez les cellules en suspension en les pipetant doucement.
note: Un pipetage doux est important pour maintenir la santé des cellules.
- Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et faire tourner à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Récupérez la pastille cellulaire après avoir retiré le surnageant et lavez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1x DPBS.
- Faites tourner la suspension cellulaire à basse vitesse de 250 x g pendant 5 min.
- Ajoutez 500 μL de DPBS et remettez les cellules en suspension par pipetage doux pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
note: Pour une meilleure précision, répétez le comptage trois fois et faites une moyenne.
- Ajustez le volume de manière à ce que la densité cellulaire finale soit de 1 x 108 cellules/ml.
- Injection sous-cutanée de cellules pour développer des xénogreffes de souris
note: Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité BSL2. Des souris athymiques Nude Foxn1nu/Foxn1+ ont été utilisées dans l’étude actuelle.
- Prélever 50 μL de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec 50 μL de matrice de membrane basale.
note: Le milieu matriciel à membrane basale a tendance à former un état gélifié à température ambiante, alors maintenez soigneusement les cellules et le mélange de milieu matriciel sur de la glace. Il est conseillé de conserver les tubes, les embouts et les seringues au réfrigérateur, puis de les transférer sur de la glace avant l’injection chez l’animal.
- Agitez le mélange pour éviter tout agglutination des cellules. Ensuite, prenez ces 100 μL du mélange de milieu cellule-suspension matricielle qui contient 5 x 106 cellules, dans une seringue de 1 cc.
- Soulevez doucement la peau de l’animal pour séparer la peau de la couche musculaire sous-jacente et injectez lentement la suspension cellulaire (100 μL) sous la peau (5 x 106 cellules), avec une aiguille de 26 G. Attendez quelques secondes avant de retirer l’aiguille, afin que le milieu de la matrice basale puisse former la structure semi-solide semblable à un gel avec des cellules sous la peau, empêchant le mélange de sortir du site d’injection.
note: Les cellules doivent être testées avant l’injection pour toute contamination susceptible de nuire aux souris immunodéficientes. Lors de l’injection, ne mettez pas l’aiguille trop profondément dans la peau car cela pourrait former la tumeur plus profondément que prévu.
- Gardez l’animal dans une cage stérile et observez-le pendant environ 20 min.
- Observez les souris pendant 2-3 semaines et laissez la tumeur croître jusqu’à 500 mm3
.
4. Localisation des anticorps à l’aide d’un système d’imagerie in vivo
REMARQUE : L’équipement d’imagerie in vivo (voir la table des matériaux) utilisé dans cette expérience utilise un ensemble de filtres à haute efficacité et d’algorithmes de démélange spectral pour la visualisation non invasive et le suivi de l’activité cellulaire et génétique au sein d’un organisme vivant en temps réel. Le système offre une capacité de surveillance de la fluorescence et de la bioluminescence.
- Injectez 25 μg d’anticorps marqués au colorant par la veine de la queue.
- Anesthésie des souris porteuses de tumeurs à l’aide de 2 % d’isoflurane. Vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de pédale.
- Une fois que les souris cessent de bouger, dilatez la veine latérale de la queue en appliquant de l’eau de ver.
- Injecter 25 μg (dans 100 μL) d’anticorps marqués à l’aide d’une seringue à insuline de 1 cc avec une aiguille de 26 G.
- De même, en tant que contrôle négatif, étiquetez et injectez l’anticorps isotype IgG1 non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses.
- Réaliser une imagerie en direct in vivo après 8, 24, 48 h, etc. d’injections d’anticorps.
- Dans le logiciel associé, cliquez sur Initialiser situé dans le panneau de configuration et vérifiez que la température de la scène est de 37 °C.
- Allumez l’alimentation en oxygène, toutes les pompes du système d’anesthésie et l’alimentation en gaz isoflurane de la chambre d’anesthésie, et réglez la valve du vaporisateur d’isoflurane sur 2 %.
- Transférez les souris dans la chambre d’anesthésie et attendez qu’elles soient complètement anesthésiées. Appliquez la pommade lubrifiante pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux.
- Allez dans le Panneau de configuration, configurez l’imagerie de fluorescence via l’option Assistant d’imagerie, et sélectionnez l’excitation à 773 nm et l’émission à 792 nm.
note: Les paramètres d’exposition automatique par défaut fournissent une bonne image fluorescente. Cependant, les préférences d’exposition automatique peuvent être modifiées selon les besoins.
- Transférez les souris anesthésiées dans la chambre d’imagerie et assemblez-les sur le champ d’imagerie à l’aide d’un cône nasal. La platine d’imagerie offre la possibilité d’accueillir 5 souris à la fois.
note: Faites imager les souris témoins avec les souris de test pour avoir une quantité similaire d’exposition et d’autres paramètres pendant l’analyse.
- Une fois que tout est prêt, sélectionnez l’option Acquérir sur le panneau de configuration pour l’acquisition d’images.
- Avec les paramètres d’exposition automatique, le système génère l’image en une minute. L’image générée est la superposition de la fluorescence sur l’image photographique avec l’intensité de fluorescence optique affichée en unités de comptage ou de photons ou en termes d’efficacité.
- Après avoir acquis l’image, transférez les souris de la chambre d’imagerie dans leur cage et observez leur récupération pendant 1 à 2 min.
- Affinez l’image à l’aide des outils et des fonctions fournis dans le logiciel pour l’analyse d’image. Les outils d’analyse d’images se trouvent dans la barre de menus et la palette d’outils.
- Sous Réglage de l’image, ajustez la luminosité, le contraste ou l’opacité, puis sélectionnez l’échelle de couleurs.
- Utilisez les outils de retour sur investissement pour spécifier une région d’intérêt (ROI) dans une image optique et mesurer l’intensité du signal dans le ROI. Si nécessaire, exportez les données de signal quantifiées vers un tableur et tracez les données.
- Pour les études de suivi, analysez côte à côte les nécropsies de souris de divers tissus (p. ex., foie, poumon, cœur, rein, rate, cerveau, etc.) afin d’obtenir une distribution non spécifique détaillée des anticorps marqués par fluorescence.
note: Les données peuvent être étayées par un test ELISA spécifique aux tissus en utilisant l’antigène (FOLR1 dans ce cas) dans 96 dosages de puits.