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1. Coloration par cytométrie en flux de cellules dérivées de monocytes infectées par Mtb
REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une installation BSL-3. La coloration par cytométrie en flux pourrait être effectuée dans une plaque de 96 puits au lieu de tubes.
- Détacher les cellules infectées par Mycobacterium tuberculosis, Mtb (et les témoins non infectés) des puits dans la ou les plaques de 6 puits par incubation avec 1 mL de tampon FACS par puits pendant au moins 30 min à 37 °C et 5 % de CO2.
- Pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont détachées. Si possible, confirmez le détachement cellulaire par microscopie. Transférez la suspension cellulaire de chaque puits dans un tube de microcentrifugation à bouchon vissé et faites tourner les tubes à 200 x g pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant par pipetage.
- Lavez deux fois la pastille cellulaire dans chaque tube avec un tampon FACS et faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min.
- Colorer les cellules (environ 0,5 x 106 à 1 x 106 cellules/tube) avec un cocktail d’environ 50 μL d’anticorps anti-humains conjugués au fluorochrome, y compris TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tableau 1) en combinaison avec le colorant de viabilité Zombie-UV pendant 30 min à 4 °C (réfrigérateur) dans l’obscurité.
- Lavez les cellules colorées deux fois avec 400 μL de tampon FACS et faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min.
- Fixez les cellules colorées avec 200 μL de tampon de fixation (fraîchement préparé) pendant 30 min à RT dans l’obscurité pour assurer l’inactivation complète des mycobactéries.
- Lavez les cellules deux fois avec 400 μL de tampon FACS et essorez à 200 x g pendant 5 min pour éliminer l’excès de tampon de fixation.
- Remettre les cellules fixées en suspension dans 400 μL de tampon FACS et transférer les échantillons dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1 mL avant de les sortir du laboratoire BSL-3 pour la cytométrie en flux dans BSL-2. Stocker les cellules colorées à +4 °C jusqu’à l’acquisition de l’échantillon.
note: Vaporisez les tubes avec de l’éthanol à 70 % avant de les sortir du laboratoire BSL-3. Le formaldéhyde est toxique (cancérigène) et doit être manipulé dans une enceinte de biosécurité de classe II. Jetez les déchets de formaldéhyde dans un déchet chimique séparé.
2. Acquisition et analyse de données de cytométrie en flux de cellules dérivées de monocytes infectées par Mtb
REMARQUE : Les étapes 2.1 à 2.2 doivent être effectuées avant la coloration par cytométrie en flux décrite ci-dessus. Pour éviter les problèmes d’agglutination cellulaire et de dissociation des colorants en tandem après la fixation de la cellule, l’acquisition d’échantillons de cellules infectées et non infectées par Mtb est effectuée dans les 4 à 10 heures suivant la coloration primaire des anticorps.
- Avant la coloration par cytométrie en flux décrite ci-dessus, compenser le signal fluorescent pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome répertorié dans le panel de coloration (tableau 1) à l’aide de billes de compensation (positives et négatives).
- Titrer la dilution de l’anticorps pour la coloration des macrophages humains afin d’obtenir le signal optimal pour chaque fluorochrome.
- Utilisez des cellules non colorées pour déterminer le niveau de fluorescence de fond nécessaire pour définir une porte pour la population cellulaire négative permettant de visualiser les cellules colorées (les macrophages sont fortement auto-fluorescents).
- Acquérir un minimum de 50 000 cellules/échantillon dans le cytomètre en flux à l’aide du logiciel recommandé pour l’acquisition des données.
- Exportez les fichiers d’acquisition du cytomètre en flux au format standard de cytométrie en flux (FCS) 3.1.
- Analysez les fichiers FCS dans un logiciel d’analyse de cytométrie en flux.
- Gate les macrophages en fonction de leurs caractéristiques de diffusion vers l’avant et sur les côtés (FSC et SSC) et excluez les cellules mortes par déclenchement de cellules vivantes/mortes à l’aide du colorant de viabilité Zombie-UV.
- Visualisez les macrophages infectés par H37Rv-GFP dans le canal FITC.
- Identifier la fréquence des cellules colorées positivement et l’intensité de fluorescence (MFI) moyenne géométrique pour tous les marqueurs (Tableau 1).
Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés pour la cytométrie en flux.
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| laser | filtre | Fluorochrome | phénotype | fonction | clone | N° de catalogue | compagnie |
| 639 | 670/30 | AF647 | TLR2 | Récepteur de reconnaissance d’agents pathogènes | TL2.1 | 309714 | BioLégende |
| 639 | 780/60 | APC-Cy7 | CD206 | Récepteur du mannose | 15-2 | Référence 321120 | BioLégende |
| 405 | Référence 610/20 | BV605 | CD163 (en anglais | Récepteur piégeur | GHI/61 | 333616 | BioLégende |
| 405 | 670/30 | BV650 | CD80 | Molécule co-stimulatrice | 2D10 | 305227 | BioLégende |
| 405 | Référence 710/50 | BV711 | CCR7 | Récepteur des chimiokines | G043H7 | 353228 | BioLégende |
| 405 | 780/60 | BV785 | CD86 | Molécule co-stimulatrice | IT2.2 | 305442 | BioLégende |
| 488 | 530/30 | GFP | VTT | Bactéries intracellulaires | | | |
| 561 | Référence 586/15 | Pe | CD200R | Récepteur inhibiteur | OX-108 | 329306 | BioLégende |
| 561 | Référence 620/14 | PE/ÉBLOUISSEMENT 594 | CD64 | Récepteur gamma Fc-I des IgG | 10.1 | 305032 | BioLégende |
| 561 | Référence 661/20 | PE-Cy5 (PC5) | HLA-DR | Molécule du CMH de classe II | L243 | 307608 | BioLégende |
| 355 | 450/50 | BUV395 | Teinture de viabilité | Marqueur de cellules vivantes/mortes | Zombie UV | 423108 | Invitrogen |