Un test in vitro pour étudier la capacité cytotoxique des cellules tueuses induites par les cytokines

Résumé

Source : Hsiao, C. H., et al. Isolement et expansion de lymphocytes T tueurs induits par des cytokines cytotoxiques pour le traitement du cancer. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une technique in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules tueuses induites par les cytokines (CIK) contre les cellules cancéreuses. Lors de la co-culture de cellules cancéreuses cibles avec des cellules CIK, les cellules cancéreuses mortes sont identifiées à l’aide d’un colorant de viabilité fluorescent et sont quantifiées à l’aide de la cytométrie en flux, estimant l’effet cytotoxique des cellules CIK.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation des matériaux

1. Stockez les réactifs, les anticorps et les produits chimiques comme indiqué dans la fiche signalétique (FDS). Dissoudre les médicaments ou les cytokines dans des solvants sous forme de solutions mères, puis aliquote pour le stockage à -20 °C ou -80 °C.
   note: Des informations détaillées pour la préparation des matériaux sont notées dans le tableau des matériaux.

2. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

1. Réchauffez la solution à gradient de densité (tableau des matériaux) à 18-20 °C avant utilisation. Retournez le flacon de solution plusieurs fois pour assurer un mélange complet.
2. Prélever 3 à 5 ml d’échantillon de sang veineux humain dans un flacon hépariné et bien mélanger en inversant doucement le tube plusieurs fois.
3. Préparez 4 mL de solution à gradient de densité dans un tube stérile de 15 mL.
4. Appliquez délicatement 1 mL de l’échantillon de sang sur la solution à gradient de densité.
5. Centrifuger à 400 x g pendant 30 min à 18−20 °C (éteindre la pause).
6. Aspirez soigneusement et immédiatement la couche leucocytaire des cellules mononucléées (environ 1 ml) à la fois pour éviter de déranger les couches dans un tube stérile de 15 ml à l’aide d’une pipette stérile de 1 ml.
7. Ajouter au moins 3 volumes (~3 ml) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la couche leutique dans le tube à centrifuger. Suspendez les cellules en les pipetant doucement de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile.
8. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 18−20 °C. Aspirer le surnageant.
9. Suspendre la pastille cellulaire avec 5 mL de milieu de base (Table des matières) et transférer dans une fiole. Cultivez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.

3. Induction et expansion CIK

1. Le jour 0, cultiver les PBMC (1 x 10⁶) dans un milieu basal frais contenant 1 000 UI/mL d’IFN-γ pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Le jour 1, rafraîchir le milieu avec un milieu basal frais contenant 50 ng/mL d’anticorps anti-CD3, 1 ng/mL d’IL-1α humaine recombinante (rh) et 1 000 U/mL d’IL-2 rh. Rafraîchissez le support tous les 3 jours.
3. Le jour 7, rafraîchir le milieu avec un milieu basal frais contenant 1 000 U/mL de rh IL-2. Rafraîchissez le milieu tous les 3 jours jusqu’à la fin de l’expansion cellulaire (jour 14).

4. Immunophénotypage pour l’évaluation des cellules CIK

1. Laver les cellules CIK avec 10 mL de PBS stérile. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g et 18−20 °C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 10 mL de PBS. Comptez le nombre de cellules et testez la viabilité de la cellule à l’aide du test d’exclusion du bleu de trypan.
2. Aliquote les cellules CIK dans six tubes stériles de 1,5 mL à une densité de ~5–10 x 10⁵ cellules/mL de PBS. Étiqueter et traiter comme suit : Tube 1, blanc (sans anticorps) ; Tube 2, ajouter 20 μL d’isotype IgG1-FITC ; Tube 3, ajouter 20 μL d’anticorps monoclonaux isotypiques IgG1-APC ; Tube 4, ajouter 20 μL de CD3-FITC ; Tube 5, ajouter 20 μL d’anticorps monoclonaux CD56-APC ; et le tube 6, ajouter 20 μL de CD3-FITC et 20 μL d’anticorps monoclonaux CD56-APC.
3. Mélangez délicatement les cellules CIK avec les anticorps en les pipetant doucement de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
4. Centrifugez les tubes pendant 10 min à 300 x g et 18−20 °C. Aspirez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire une fois avec 1 mL de PBS. Pipetez-les doucement de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml.
5. Répétez l’étape 4.4.
6. Laissez les tubes dans l’obscurité avant l’analyse cytométrique en flux.

5. Reconnaissance des marqueurs de CD

1. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile à fond rond en polystyrène de 5 ml avec un capuchon de crépine cellulaire (maille de 100 μm) en pipetant doucement à travers le bouchon. Mettez les tubes sur le carrousel dans l’ordre.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et créez un dossier expérimental. Cliquez sur le bouton Nouvel échantillon pour ajouter un échantillon et un tube à l’expérience et nommez les tubes comme suit : Tube 1, Vierge ; Tube 2, Isotype IgG1-CD3; Tube 3, Isotype IgG1-CD56; Tube 4, CD3 ; Tube 5, CD56 ; Tube 6, CD3CD56.
3. Créez un système de contrôle de dispersion pour les populations de cellules CIK (Figure 1A).
   1. Sélectionnez Tube 1 (Blank) et cliquez sur le bouton Dot Plot pour créer un graphique FSC-A/SSC-A. Tracez une porte rectangulaire sur l’ensemble de la population cellulaire avec un seuil FSC-A >5 x 10⁴ pour exclure les débris cellulaires.
   2. Sélectionnez le paramètre SSC-A/SSC-H pour le nouveau graphique à points et tracez une porte polygonale autour de toutes les cellules individuelles. Sélectionnez les paramètres Count/FITC (CD3) et Count/APC (CD56) pour le nouveau tracé d’histogramme, respectivement. Sélectionnez le paramètre FITC (CD3)/APC (CD56) pour le nouveau graphique à points et tracez une porte à quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations.
   3. Enregistrez les données de 20 000 cellules individuelles dans chaque échantillon. Cliquez sur le bouton Charger l’échantillon pour analyser d’abord l’échantillon de contrôle vierge. Identifiez l’ensemble de la population de cellules CIK à l’aide des paramètres des canaux CD56 et CD3.
4. Répéter l’étape 5.3 pour l’examen de tous les échantillons.
5. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de l’échantillon individuel pour analyser les populations de cellules CIK et réimprimez-les dans des fichiers d’analyse.

6. Culture et coloration de cellules K562 de leucémie myéloïde chronique humaine et de cellules OC-3 du cancer de l’ovaire

1. Cellules K562
   1. Cultiver des cellules K562 dans un milieu complet (milieu basal RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal [FBS] et 50 U/mL d’antibiotiques et ajuster la glycémie à 4,5 g/L) à une densité de 0,5 à 1 x 106 cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Transférez le milieu de culture contenant les cellules K562 dans des tubes stériles de 50 mL et granulez les cellules à 300 x g pendant 10 min à 18−20 °C le jour de l’expérience.
   3. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 5 mL de PBS stérile et mélangez bien délicatement.
   4. Granulez les cellules à 300 x g pendant 10 min. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans du PBS et ajustez les cellules K562 à une concentration de 0,5-1 x 10⁶ cellules/mL.
   5. Ajouter 0,5 μL de colorant carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE) à 1 mL de suspension cellulaire K562 dans un tube stérile de 15 mL à une concentration finale de 5 μM. Mélanger doucement la suspension en pipetant de haut en bas au moins 3 fois.
   6. Laissez le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 10 à 15 min.
   7. Ajouter 9 mL de PBS dans le tube et granuler les cellules à 300 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant, puis suspendre la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu complet. Transférez la suspension cellulaire dans un flacon de culture cellulaire et placez-la dans l’incubateur.
2. Cellules OC-3
   1. Cultiver des cellules OC-3 dans un milieu complet (milieu DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 50 U/mL d’antibiotiques) à une densité de 0,5–1 x 10⁶ cellules dans un flacon de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Aspirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS 1 jour avant l’expérience.
   3. Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de solution d’enzyme de dissociation cellulaire (Table des matériaux) et incubez pendant 5 min à 37 °C.
   4. Mettez les cellules en suspension en ajoutant 5 mL de PBS et mélangez bien délicatement. Granulez les cellules à 300 x g pendant 10 min et aspirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans le PBS et ajuster les cellules à une concentration de 0,5 à 1 x 10⁶ cellules/mL.
   5. Ajouter 0,5 μL de colorant CFSE à 1 mL de suspension cellulaire OC-3 dans un tube stérile de 15 mL à une concentration finale de 5 μM. Mélanger doucement la suspension en pipetant de haut en bas au moins 3 fois.
   6. Laissez le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 10 à 15 min.
   7. Ajouter 9 mL de PBS dans le tube et granuler les cellules à 300 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant, puis suspendre la pastille cellulaire avec un milieu complet. Semez 5 x 10⁵ cellules/puits dans une plaque à 6 puits et incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.

7. Dosage cytotoxique

1. Coculture de cellules CIK et K562 (CIK-K562)
   1. Comptez les cellules K562 à partir de l’étape 6.1.7 et testez la viabilité cellulaire par un test d’exclusion au bleu de trypan. Ajouter 1 mL de cellules K562 dans chaque puits dans une plaque à 6 puits à une densité de 5 x 10⁵/mL.
   2. Ajouter 1 mL de milieu basal avec ou sans cellules CIK de l’étape 3.4 à la plaque à 6 puits de l’étape 7.1.1 comme suit : Puits 1 = blanc, cellules K562 seules (5 x 10⁵) ; Puits 2 = cellules K562 colorées au CFSE seules (5 x 10⁵) ; Puits 3 = cellules CIK (E [effecteur], 25 x 10⁵) + cellules K562 colorées au CFSE (T [cible], 5 x 10⁵) ; Puits 4 = cellules CIK (E, 50 x 10⁵) + cellules K562 colorées au CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Mélangez les suspensions cellulaires en les pipetant doucement de haut en bas au moins 3 fois. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 24 h.
2. Coculture de cellules CIK et OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Ajouter 1 mL de milieu basal avec ou sans cellules CIK de l’étape 3.4 à la plaque à 6 puits de l’étape 6.2.7 comme suit : Puits 1 = Cellules OC-3 vierges seules (5 x 105) ; Puits 2 = cellules OC-3 colorées au CFSE seules (5 x 10⁵) ; Puits 3 = cellules CIK (E, 25 x 10⁵) + cellules OC-3 colorées au CFSE (T, 5 x 10⁵) ; Puits 4 = cellules CIK (E, 50 x 10⁵) + cellules OC-3 colorées au CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Mélangez les suspensions cellulaires en les pipetant doucement de haut en bas au moins 3 fois. Mettez la plaque dans l’incubateur pendant 24 h.
3. Coloration au colorant 7-aminoactinomycine D (7-AAD)
   1. Récoltez la suspension cellulaire CIK-K562 de l’étape 7.1.3 directement dans un tube stérile de 15 ml.
   2. Récoltez les cellules en suspension et les cellules adhérentes des groupes CIK-OC-3 à partir de l’étape 7.2.2.
      1. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 ml. Lavez le puits avec 1 ml de PBS stérile, recueillez le PBS et ajoutez-le dans le tube. Ajouter 0,5 mL de solution d’enzyme de dissociation cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 °C.
      2. Ajoutez 1 ml de la solution du même tube dans le puits correspondant et mélangez doucement les cellules en les pipetant de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml. Rassemblez toutes les cellules dans le même tube.
   3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS stérile. Granulez les cellules à 300 x g pendant 10 min, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 100 μL de PBS stérile.
   4. Ajouter 5 μL de colorant 7-AAD (50 ng/μL de stock) à la suspension cellulaire. Mélangez délicatement les cellules en les pipetant de haut en bas au moins 3 fois avec une pipette stérile de 1 ml. Incuber pendant 10 min et laisser dans l’obscurité avant l’analyse.
4. Dosage de la capacité cytolytique
   1. Mélangez la suspension cellulaire à partir de l’étape 7.3.4 et répétez les étapes 5.1 et 5.2 une fois.
   2. Cliquez sur le bouton Nouvel échantillon pour ajouter un échantillon et un tube à l’expérience et nommez les tubes comme suit : Tube 1, cellules K562 (ou OC-3) uniquement ; Tube 2, cellules K562 (ou OC-3) colorées CFSE uniquement ; Tube 3, E :T = 5:1 ; Tube 4, E :T = 10:1.
   3. Créez un système de contrôle de dispersion pour le test cytolytique (Figure 2A).
      1. Sélectionnez le tube 1 et cliquez sur le bouton Dot Plot pour créer un graphique FSC-A/SSC-A. Tracez une porte rectangulaire sur tous les événements avec un seuil FSC-A >5 x 10⁴ pour exclure les débris de cellule.
      2. Sélectionnez le paramètre SSC-A/CFSE pour le nouveau diagramme à points. Sélectionnez le paramètre 7-AAD/CFSE pour le nouveau graphique à points et dessinez une porte à quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations.
      3. Cliquez sur le bouton Charger l’échantillon pour analyser d’abord l’échantillon de contrôle vierge.
      4. Ajustez la tension du SSC-A et du FSC-A. Identifiez la population de cellules mortes à l’aide des paramètres CFSE et 7-AAD. Enregistrez les données de > 20 000 cellules CFSE+ dans chaque échantillon.
   4. Répéter la section 7.4.6 pour l’analyse de tous les échantillons.
   5. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de chaque échantillon individuel pour analyser les populations de cellules non viables et exporter les données dans des fichiers d’analyse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
7-Amino actinomycine D	Bd	559925
Anticorps anti-CD56 humain de souris APC	Bd	555518	Réf. B159
Souris APC IgG1, contrôle de l’isotype κ	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Cytomètre en flux	Bd	338962		SN : R33896202856
Este de diacétate de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFSE)	Bd	565082		Reconstritution du colorant CFSE (500 mg) avec 90 mL de DMSO
Solution de D-(+)-glucose	sigma	Référence G8644		Pour la culture cellulaire K562. Ajouter 12,5 mL à 500 mL de milieu complet
Aigle modifié de Dulbecco moyen/F12	HyClone	SH30023.02		Milieu basal pour la culture cellulaire OC-3
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30084.03		Pour la culture cellulaire K562 et OC-3. Le support complet contient 10 % de FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Sciences de la vie	Référence 71101700-EK		Solution de gradient de densité
FITC Souris Anticorps anti-CD3 humain	Bd	555332	UUCHT1
FITC souris IgG1, contrôle de l’isotype κ	Bd	555748	MOPC-21
Anticorps monoclonaux anti-CD3 humains	Takara	T210	OKT3	Ajouter 2,5 mL de bouillon (1 mg/1 mL) à 50 mL de milieu à induction. Stock de stockage à -80 °C
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140122		Ajouter 5 mL de stock (10 000 U/mL) à 500 mL de milieu complet. Stock de stockage à 4 °C.
Proleukine	NOVARTIS			Reconstitution de la poudre de Proleukin (22 x 106 UI) avec 1,2 mL d’eau stérile et ajouter 2,7 mL à 50 mL de milieu d’induction. Stock de stockage à -20 °C
Interféron-gamma humain recombinant	CellGenix (en anglais)	Référence 1425-050		Reconstitution de rh IFN-g (5x105 UI/50 μg) avec 200 μL d’eau stérile et ajouter 20 mL à 50 mL de milieu d’induction. Stock de stockage à -20 °C
Interleukine-1 alpha humaine recombinante	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution de l’IL-1α (10 μg) avec 1 mL d’eau stérile et ajouter 5 mL à 50 mL de milieu d’induction. Stock de stockage à -20 °C
RPMI1640 moyen	Gibco	Référence 11875-085		Milieu basal pour la culture cellulaire K562. Stock de stockage à 4 °C
Centrifugeuse Sigma 3-18K	sigma	Référence 10295
Enzyme TrypLE Express	Gibco	12605028		Enzyme de dissociation cellulaire ; Pour le détachement des cellules adhérentes. Conservation à température ambiante
X-VIVO 15 moyen	Lonza	04-418Q		Milieu basal pour les cellules PBMC et CIK. Stockage à 4 °C