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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation du réactif
- Préparez la solution mère du milieu de culture pour le prélèvement de tissus entiers : 1 L de milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM), 110 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL d'insuline stérilisée par filtre (concentration finale de 0,1 %). Conserver la solution mère à 4 °C.
- Préparez le tampon chélateur #1 : 30 mL de milieu de culture (tel que décrit à la section 1.1), 600 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 M (concentration finale 10 mM), 300 μL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 μL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Conserver la solution mère à 4 °C.
- Préparez le tampon chélateur #2 : 30 ml de milieu de culture (tel que décrit à 1.1), 300 μL d’EDTA 0,5 M (concentration finale 5 mM), 300 μL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 μL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Conserver la solution mère à 4 °C.
- Préparer un milieu miniintestinal humain : 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (10 %), 500 L de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %), 500 L de L-glutamine (concentration finale de 1 %), 500 L de gentamicine (concentration finale de 1 %), 100 L d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %), 500 L d’acide 1 M N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES) (concentration finale de 10 mM), 500 μL de 100 suppléments de N-2 et 1 mL de 50 suppléments de B-27 moins de vitamine A pour un volume total de 50 mL. Conserver la solution mère à -20 °C.
- Préparation du milieu Minigut humain complet : 10 mL de milieu Minigut humain (préparé en 1.4), 10 μL de 100 μg/mL de Wnt3a (concentration finale de 100 ng/mL), 10 μL de 100 μg/mL de Noggin (concentration finale de 100 ng/mL), 10 μL de R-Spondin de 1 mg/mL (concentration finale de 1 μg/mL), 10 μL de facteur de croissance épidermique (EGF) de 500 μg/mL (concentration finale 50 ng/mL), 10 μL de 1 M de N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 10 μL de 10 mM Y-27632 (concentration finale de 10 μM), 10 μL de 500 μM A-83 (concentration finale de 500 nM), 10 μL de 10 mM SB202190 (concentration finale de 10 μM), 100 μL de nicotinamide 1 M (concentration finale 10 mM) et 1 μL de 100 μM [leu] 15-gastrine 1 (concentration finale 10 nM). Volume total 10 mL. Conserver la solution mère à 4 °C
note: Les solutions doivent être utilisées dans les 48 heures.
2. Isolation et placage de cryptes à partir de tissus entiers
- Au moment du prélèvement dans la salle d'opération, placez l'échantillon de tissu intestinal grêle humain dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) froide. Lavez l’échantillon dans du DPBS froid jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de selles ni de sang. Stocker l’échantillon à 4 °C dans le milieu RPMI 1640 jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’isolement des cryptes.
note: Les tissus ne peuvent pas être conservés pendant plus de 24 heures.
- Assurez-vous que l’échantillon est exempt de selles et de sang. À l’aide de ciseaux à dissection délicates, retirez tout excès de graisse ou de clips/agrafes chirurgicaux, etc. Peser l’échantillon.
REMARQUE : Visez un morceau d’environ 0,75 à 2,5 g.
- Coupez l’échantillon en morceaux de 0,5 cm et placez-le dans 30 mL de tampon chélateur #1 (tel que préparé à l’étape 1.2).
- Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 °C.
- Filtrer le tissu à travers une crépine cellulaire de 100 μm et jeter le flux à travers.
- Ajouter le mouchoir à 30 ml de tampon chélateur #2 (tel que préparé à l’étape 1.3).
- Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 °C.
- Filtrer le tissu à travers une crépine de 100 μm et jeter à travers.
- Décongeler 500 ml de matrice de membrane basale sur de la glace pour l’utiliser à l’étape 2.8.
- Ajouter un mouchoir à 10 mL de DMEM froid dans un tube conique de 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
- Filtrer à travers une crépine de 100 μm et recueillir le flux (Étiquette #1). Gardez le tube #1 sur de la glace.
- Ajoutez un mouchoir à 10 ml de DMEM froid dans un tube conique séparé de 50 ml et secouez vigoureusement à la main pendant 10 secondes.
- Filtrer à travers une crépine de 100 μm et recueillir le flux (étiquette #2).
- Répétez deux fois de plus jusqu’à ce qu’il y ait quatre tubes coniques avec écoulement (tubes étiquetés #1-4).
- Passer la solution du tube filtrant #1 à travers une crépine à cellules de 100 μm et transférer le flux dans un tube conique de 15 mL (étiquette #1). Répétez l’opération pour #2-4.
- Centrifugeuse 15 mL tubes #1-4 à 200 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Dans la hotte à flux laminaire, retirez le surnageant des tubes #1-4 et jetez-le. Évitez de perturber le nuage de tissu immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser un certain surnageant derrière vous.
- En pipetant lentement, mélangez la pastille avec le surnageant restant dans les tubes #1-4.
- Transférez le mélange des tubes #1-4 dans un seul tube conique de 2 ml.
- Centrifuger le tube conique à 200 x g pendant 20 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de la matrice de la membrane basale.
note: Gardez la matrice de la membrane basale sur la glace en tout temps et travaillez rapidement pour les prochaines étapes. Ce produit polymérise très rapidement à température ambiante.
- Appliquer 50 μL de suspension matricielle de l’échantillon/membrane basale au centre d’un puits dans une plaque de 24 puits. Cela devrait apparaître en forme de dôme.
note: L’utilisation de pointes de pipette réfrigérées facilite le transfert de la suspension, minimisant ainsi la polymérisation.
- Répétez l’opération 9 fois pour remplir 10 puits au total.
- Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre la polymérisation.
- Ajouter 500 μL de Human Minigut Media Complete (tel que préparé à l’étape 1.5) dans chaque puits. Remplacez tous les 2 jours.
- Collectez les entéroïdes après 5 à 10 jours, lorsque le bourgeonnement est visualisé. Voir les étapes 4 et 5 pour les instructions de collecte.
3. Induction de NEC expérimentale
- Ajouter 10 μL de 5 mg/mL de lipopolysaccharide (LPS) à 500 μL de Human Minigut Media Complete (tel que préparé à l’étape 1.5) dans chaque puits le jour 0. Remplacer tous les 2 jours jusqu’à la collecte.