Essai d’adhésion in vitro pour détecter l’adhérence des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles

Dans cet article

Résumé

Najmeh, S., et al. Isolation et manipulation simplifiées des pièges extracellulaires à neutrophiles humains. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test utilisant la microscopie à fluorescence pour détecter l’adhésion des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles (TNE). Dans les puits d’essai, il y a une augmentation notable du nombre de cellules cancéreuses marquées par fluorescence adhérant aux TNE, tandis que les puits traités avec de la DNase présentent une adhésion réduite des cellules cancéreuses aux TNE.

Protocole

1. Test d’adhésion statique des cellules cancéreuses NET-

Ajouter 100 μl de la pâte NET obtenue précédemment par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits et laisser enrober les puits O/N à 4 °C dans l’obscurité.
Entre 12 et 20 heures plus tard, vérifiez la formation d’une monocouche uniforme de TNE acellulaires au fond des puits au microscope (Figure 1). À ce stade, aspirez doucement tout matériau non adhérent hors des puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche NET au fond.
Ajouter 100 μl de solution bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans chaque puits et laisser agir 1 h à RT.
Détacher les cellules cancéreuses A549 d’une fiole T-75 à l’aide de 2 ml de solution de trypsine à 0,25 %. Une fois détachés, ajouter 10 ml de milieu A549 dans les cellules trypsinisées et centrifuger à 450 x g à 4 °C pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans les milieux pour obtenir une concentration de 2 x 10 4^{cellules cancéreuses}par 100 μl de milieu.
note: Les cellules A549 ont été cultivées séparément. Brièvement, les cellules ont été cultivées et maintenues dans un milieu DMEM F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine et incubées à 37 °C et 5 % de CO₂. Une fois que la confluence cellulaire de 70 à 80 % a été atteinte, ils ont été détachés à l’aide de trypsine-EDTA à 0,25 % et remis en suspension dans le même milieu décrit ci-dessus.
Colorer les cellules cancéreuses à l’aide de CFSE en ajoutant 1 μl de CFSE par ml de milieu et en le laissant colorer à RT pendant 10 min. Après la coloration, centrifuger à 450 x g à 4 °C pendant 5 min, puis jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le volume initial de milieu pour obtenir une concentration de 2 x 10 4 cellules cancéreuses par 100 μl de milieu.
Après 1 heure de blocage des TNE, aspirez doucement la solution de blocage et ajoutez 2 cellules cancéreuses x10⁴dans un milieu, ce qui équivaut à 100 μl, par puits sur la monocouche de TNE et laissez-la adhérer pendant 90 min à 37 °C 5 % CO₂. Aspirez doucement les cellules et ajoutez 100 μl de PBS dans chaque puits pour laver les cellules non adhérentes.
Dans certains puits, ajouter 1000U de DNAse I par puits pendant 10 min avant le lavage pour dégrader les TNE. Cela servira de contrôle négatif. Dans les autres puits, ajoutez 100 μl d’eau stérile par puits pendant 10 min, qui servira de contrôle du véhicule (VC).
REMARQUE : 3 répétitions par condition sont généralement effectuées pour augmenter la taille de l’échantillon.
Aspirez et jetez toutes les solutions dans les puits en ne laissant que les TNE et les cellules cancéreuses adhérentes au fond. Ajouter 100 μl de solution de formaldéhyde à 4 % par puits pour fixer les cellules cancéreuses adhérentes aux TNE et lire le test au microscope à fluorescence (figure 1). Tracez et analysez les résultats (Figure 2).

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Résultats

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Graphique 1. Monocouche de filet. Les images de microscopie optique des puits de plaques de 96 puits recouverts de TNE montrent (A) une monocouche uniforme de TNE dans tout le puits, par opposition à (B) un revêtement inadéquat du puits avec une couche interrompue de TNE. Les barres d’échelle représentent 40 μm.