Coloration des cellules bactériennes et préparation pour les études immunologiques

Résumé

Source : Yang, J. et al., Détection automatisée à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes.J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la coloration et la préparation de cellules bactériennes pour des études immunologiques à l’aide d’un colorant fluorescent rouge. Les bactéries colorées sont diluées et remises en suspension dans un milieu de croissance pour atteindre la concentration bactérienne souhaitée pour l’infection des cellules hôtes, représentant la multiplicité de l’infection.

Protocole

1. Croissance bactérienne et coloration

1. Effectuer tous les travaux bactériens dans une enceinte de biosécurité, laboratoire de biosécurité de niveau 2.
2. Inoculer toutes les cultures bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, etc., à partir du stock de glycérol congelé et les cultiver dans un bouillon de soja tryptique (TSB, 3 mL) dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant la nuit maintenu à 250 tr/min.
3. Le lendemain, utilisez une dilution de 1:100 de la culture de nuit pour inoculer une sous-culture et les cultiver dans du TSB (1 mL) pendant 3 h jusqu’à la phase exponentielle, mesurez la densité optique, DO à 600 nm (DO₆₀₀) pour confirmer. Assurez-vous que la DO₆₀₀ est dans la plage de 0,4 à 0,6.
4. Avant d’effectuer l’essai d’adhérence bactérie-hôte, des dilutions en série de suspension bactérienne sur des plaques de gélose TSB, les incuberont pendant une nuit à 37 °C, puis établiront les unités formant des colonies bactériennes, les UFC à partir du nombre de colonies. Pour P. aeruginosa, une DO₆₀₀ de 1,0 correspond à 2 x 10⁸ cellules bactériennes viables/mL, et pour L. monocytogenes, une DO₆₀₀ de 1,0 correspond à 9 x 10⁸ cellules bactériennes viables/mL.
5. Récoltez les cultures bactériennes en phase exponentielle par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min à température ambiante (RT), puis lavez-les une fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1 mL). Remettre les granulés bactériens en suspension dans 1 mL de 1x PBS et déterminer les concentrations en mesurant la DO₆₀₀ des suspensions bactériennes. Par exemple, P. aeruginosa avec une OD₆₀₀ de 0,5 représente une concentration de 1 x 10⁸ cellules bactériennes/mL.
6. Teindre la suspension bactérienne à l’aide d’un colorant fluorescent vert ou rouge à RT pendant 30 minutes avec une rotation douce dans l’obscurité. Pour cela, ajoutez 2 μL du colorant de coloration concentré 500 fois dans 1 mL de suspension bactérienne pour diluer le colorant 1 fois. Pour éliminer le colorant colorant, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 x g pendant 2 minutes et remettez la pastille en suspension dans 1 ml de 1x PBS trois fois.
   note: Si des bactéries marquées en fluorescence (protéine fluorescente verte (GFP-), protéine fluorescente rouge (RFP-), mCherry-, etc.) sont utilisées dans l’expérience, sautez cette étape de coloration bactérienne. P. aeruginosa marqué à la GFP et L. monocytogenes coloré au colorant fluorescent rouge ont été utilisés dans ce protocole.
7. Prélever les cellules bactériennes colorées ou les bactéries marquées à la GFP par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min. Remettre en suspension dans un milieu F-12K frais (1 mL) et mesurer la DO₆₀₀ de chaque culture. Par la suite, diluez les cultures aux concentrations souhaitées en fonction de la multiplicité de l’infection (MOI) et de la concentration de la cellule hôte. Le volume final utilisé dans cette expérience est de 500 μL.
   note: Par exemple, si la concentration de cellules hôtes comptée à l’aide de la coloration au bleu trypan est de 1 x 10⁵ cellules/mL, la concentration souhaitée de cellules bactériennes à un moment d’inertie de 100 sera de 1 x 10⁷ cellules/mL. La concentration de P. aeruginosa à 0,5 OD₆₀₀ est de 1 x 10⁸/mL. Pour obtenir la concentration désirée, diluez la culture de P. aeruginosa 10 fois et ajoutez 50 μL de culture en suspension à 450 μL de milieu F-12K frais.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 fois par PBS	VWR	Référence 45001-130
BactoView Live Rouge	Biotium	Référence 40101	Colorant antibactérien
centrifugeuse	Eppendorf	5810R
E. coli			Stock de laboratoire
F-12k moyen	ATCC	302004	Milieu de culture cellulaire A549
Sérum fœtal bovin	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			Les collections du NIST
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Stock de laboratoire de la Dre Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Stock de laboratoire de la Dre Lori Burrows
S. agalactiae			Les collections du NIST
S. aureus	Le	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	Le	NR-48164
S. rubidaea			Les collections du NIST
Bouillon de soja typique	Cellules de croissance	Référence MBPE-4040