Détection de la liaison de la vitronectine aux surfaces bactériennes à l’aide de la cytométrie en flux

Abstract

Source : Singh, B. et al., Assays for Study the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance.J. Vis. Exp.(2018)

Cette vidéo démontre la détection de l'interaction de la vitronectine avec les protéines de surface bactériennes. L’analyse par cytométrie en flux mesure le signal de fluorescence des anticorps marqués par fluorescence liés à la vitronectine, confirmant sa présence à la surface de la bactérie. Cette technique donne un aperçu des interactions hôte-pathogène et des thérapies potentielles contre les infections bactériennes.

Protocol

1. Analyse de la vitronectine, Vn en tant que protéine-ligand de surface bactérienne

1. Détection de la liaison Vn à la surface de la bactérie à l’aide de la cytométrie en flux
   note: En cytométrie en flux, nous avons utilisé la diffusion latérale et la diffusion directe pour bloquer les événements positifs. Pour examiner les interactions avec Vn, les isolats cliniques d’Haemophilus influenzae de type f, Hif (n = 10) ont été sélectionnés avec E. coli BL21 (DE3) en tant que témoin négatif (figure 1A).
   1. Culture d’isolats cliniques Hif dans un milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI) complété par 10 μg/mL de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et d’hémine à 37 °C avec agitation à 200 tr/min. Utilisez le milieu Luria-Bertani pour cultiver E. coli. Récolter Hif en phase mi-logarithmique (densité optique, DO₆₀₀ = 0,3) et remettre les bactéries en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) (tampon bloquant ; PBS-BSA). Ajustez la suspension à 10⁹ unités formant colonies, UFC/mL.
   2. Transvasez les aliquotes contenant 5 x 10⁶ UFC dans des tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL (12 x 75 mm²) et ajoutez 1 mL de tampon de blocage. Centrifugez la suspension à 3 500 × g à température ambiante (RT) pendant 5 min pour granuler les bactéries, puis aspirez soigneusement pour éliminer le surnageant sans perturber le granulé.
   3. Remettre les pastilles bactériennes en suspension avec 50 μL de tampon de blocage contenant 250 nM Vn et incuber les échantillons pendant 1 h à RT sans agitation. Après l’incubation, granulez les bactéries par centrifugation à 3 500 x g pendant 5 min, puis lavez les granulés trois fois à l’aide de PBS et d’étapes de centrifugation similaires.
   4. À la pastille bactérienne, ajoutez 50 μL d’anticorps polyclonaux (pAbs) primitifs anti-Vn humains de mouton à une dilution de 1:100 dans PBS-BSA. Incuber la suspension pendant 1 h à l’heure de l’artérence, puis laver les bactéries trois fois avec du PBS pour éliminer les anticorps non liés (comme décrit à l’étape 1.1.3).
   5. Ensuite, ajoutez 50 μL de PBS-BSA contenant des pAbs anti-moutons conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine isothiocyanate (FITC) et incubez à RT pendant 1 h dans l’obscurité.
   6. Préparez un témoin à blanc en incubant des bactéries avec un tampon de blocage seulement et des pAbs sans Vn.
   7. Laver les bactéries trois fois avec 1 mL de tampon de blocage et granuler la suspension par centrifugation, comme décrit à la section 1.1.2. Enfin, remettez en suspension la pastille bactérienne avec 300 μL de PBS et analysez-la par cytométrie en flux.

Results

Figure 1 : Haemophilus influenzae sérotype f se lie à Vn via le PH exprimé en surface.(A) Résultats de cytométrie en flux montrant la liaison de Vn aux cellules des isolats cliniques de Hif. Chaque isolat clinique (5 x 10⁶ UFC) a été incubé avec 250 nM de Vn humain. Le ligand lié a été détecté à l’aide de pAbs anti-Vn de mouton et d’anticor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL	BD Faucon	Référence 60819-138	12 × 75 mm
Albumines sériques bovines (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Convient pour la culture cellulaire
Cytomètre en flux	BD Biosciences	651154	Qualité d’analyse cellulaire pour les applications de recherche
Vitronectine (Vn) à partir de plasma humain	Sigma-Aldrich	Réf. V8379-50UG	Qualité de culture cellulaire
Hôte d’E. coli (E. Coli BL21)	Novagen	Référence 69450-3	Hôte d’expression protéique
Anticorps anti-mouton d’âne conjugués au FITC	AbD Serotec	STAR88F	Polyclonal
Anticorps anti-Vn humains de mouton	AbD Serotec	AHP396	Polyclonal